Klinikai vonatkozások

A mikroszatellita-instabilitás (MSI) a rövid ismétlődő DNS-szekvenciákban történő deléciók/beépülések szisztematikus felhalmozódásából ered a hibás illesztésjavító (MMR) rendszerrel rendelkező tumorsejtekben. Az MSI az összes vastagbélrák mintegy 15%-ában fordul elő, és klinikailag hasznos az MMR-gének csíravonalbeli mutációi által okozott örökletes nem polipozitású vastagbélrákban (HNPCC, Lynch-szindróma) szenvedő betegek azonosítására. Az MSI-státusz előre jelezheti a rák bizonyos kemoterápiákra adott válaszát/rezisztenciáját is.

Az MSI-analízis standardizálására tett kísérletként a Nemzeti Rákintézet (NCI) 1997-es műhelye egy öt mikroszatellita markerből álló referenciapanelt ajánlott az MSI kimutatására, és az eredmények alapján MSI-osztályozási irányelveket állapított meg. A Bethesda panelként emlegetett referenciapanel két mononukleotid lókuszból (Big Adenine Tract vagy BAT-25 és BAT-26) és három dinukleotid lókuszból (D2S123, D5S346 és D17S250) áll. A Bethesda panelt használva azokat a rákokat, amelyeknél e lókuszok közül kettőnél vagy annál többnél volt instabilitás, MSI-magas (MSI-H), és azokat a rákokat, amelyeknél az öt lókusz egyikénél sem volt instabilitás, mikroszatellita-stabilnak (MSS) tekintették. Az NCI egy további nyomon követő munkaértekezletén felismerték, hogy az eredeti Bethesda panel érzékenysége és specificitása korlátozott lehet a dinukleotid ismétlődések bevonása miatt, amelyek kevésbé érzékenyek és specifikusak, mint a mononukleotid ismétlődések az MMR-hiányos rákok azonosítására. Felmerült, hogy a kvázimonomorf mononukleotid ismétlődések panelje elég érzékeny és specifikus lehet az MSI magas rákos megbetegedések kimutatásához, és szükségtelenné teheti a vizsgált tumorok normál megfelelő DNS-ét (1-8).

MSI Analysis System (Research Use Only kit, Version 1.2, Promega Corporation).

Az MSI Analysis System egy multiplex, fluoreszcens PCR-alapú vizsgálat a mikroszatellita-instabilitás kimutatására. Az MSI Analysis System fluoreszcensen jelölt primereket tartalmaz öt kvázimonomorf mononukleotid ismétlődő marker (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 és MONO-27) koamplikációjához. A PCR-termékek szétválasztása kapilláris elektroforézissel (CE) történik Applied Biosystems 3500Dx Genetic Analyzer segítségével. A mikroszatellita-instabilitás 2 vagy több mononukleotid lokuszon MSI-magasnak minősül; a mikroszatellita-instabilitás egyetlen mononukleotid lokuszon vagy a vizsgált lokuszok egyikénél sem mutatkozó instabilitás mikroszatellita-stabilnak (MSS) minősül. Jellemzően az MSI-magas értékű minták minden lókuszon instabilitást mutatnak, a termékméret átlagosan 5-9 bázissal csökken. Az MSI jelenléte legalább 99%-os analitikai specificitással és legalább 5%-os kimutatási határral mutatható ki.

Az MSI elemző rendszer fontos tervezési jellemzője az öt különböző lókusz közötti távolság, amely általában meghaladja az MSI jelenléte esetén jellemzően eltolódott bázisok számát (átlagosan 5-9 bázis). A leghosszabb PCR-amplikon mérete 154 bázispár, ami előnyös a formalinban rögzített, paraffinba ágyazott szövetek (FFPE) elemzésénél.

Ez a vizsgálat a nagy áteresztőképességű rutin MSI-vizsgálatok standardja, különösen akkor, ha ugyanazon a DNS-mintán más downstream molekuláris vizsgálatokat is kérnek.

Mintakövetelmények

A vizsgálathoz elfogadható minták a formalinban fixált, paraffinba ágyazott kolorektális karcinóma szövetminták, 6-48 órás fixálási idővel.

Térfogat

1 reprezentatív paraffinblokk előnyben részesül. Alternatívaként rezekciós minták esetén legalább 5 festetlen szövetszelvény (5 µm vastag) szükséges.

Tárolási és szállítási utasítások

A mintákat szobahőmérsékleten kell tárolni és szállítani.

Korlátozások

Elégtelen tumortartalom nem teszi lehetővé az MSI-instabilitás kimutatását: a tumorsejtek 10%-a szükséges. A tumortartalmat az elemzés előtt értékelik, és makrodissectiót végeznek. A formalinon kívüli fixálószerek vagy a hosszabb fixálási idő nem megfelelő eredményeket eredményezhet.

Speciális követelmények

Nincs.

Megmunkálási idő

Öt-7 munkanap a tárgylemezek és paraffinblokkok esetében.

2. IdyllaTM MSI Assay (CE-IVD) – akkreditáció folyamatban

Az IdyllaTM MSI Assay (RUO) a mikroszatellita-instabilitás kimutatását végzi közvetlenül formalinban rögzített, paraffinba ágyazott (FFPE) emberi rákszöveti metszetekből, PCR-reakciót alkalmazva, amelyet nagy felbontású olvadási görbeelemzés követ az IdyllaTM műszeren.

A teszt 7 monomorf homopolimer lókuszban végez mutációk kimutatását a mikroszatellita-instabilitással járó humán rákos megbetegedések azonosítására (ACVR2A, BTBD7, DIDO1, MRE11, RYR3, SEC31A és SULF2). Ezek a biomarkerek tumorspecifikusak, nagy gyakoriságot mutatnak a vastagbél- és az endometriumrákban, és különböző etnikumokban stabilak. Ráadásul ezek a tumorspecifikus biomarkerek nem igénylik a párosított normál szövetminták elemzését.

A minta MSI-státusát mind a 7 biomarker végső lehívásával határozzák meg. A mikroszatellita-instabilitás 2 vagy több mononukleotid lokuszon MSI-magasnak értelmezhető; a mikroszatellita-instabilitás egyetlen mononukleotid lokuszon vagy a vizsgált lokuszok egyikénél sem mutatkozó instabilitás mikroszatellita-stabilnak (MSS) értelmezhető.

Ez a vizsgálat lehetővé teszi az alacsony áteresztőképességű MSI-vizsgálatot, és ideális reflex- vagy mentővizsgálatra a pontos MSI-eredmény gyors megszerzése vagy megerősítése érdekében.

Mintakövetelmények

A vizsgálathoz elfogadható minták a formalinban fixált, paraffinba ágyazott kolorektális karcinóma szövetminták, 6-48 órás fixálási idővel.

Térfogat

1 reprezentatív paraffinblokk előnyben részesül. Alternatívaként rezekciós minták esetén legalább 2 festetlen szövetszelvény (5 µm vastag; 50-600 mm²) szükséges.

Tárolási és szállítási utasítások

A mintákat szobahőmérsékleten kell tárolni és szállítani.

Korlátozások

Elégtelen tumortartalom nem teszi lehetővé az MSI-instabilitás kimutatását: a tumorsejtek 20%-a szükséges. A tumortartalmat az elemzés előtt értékelik, és makrodissectiót végeznek. A formalinon kívüli fixálószerek vagy a hosszabb fixálási idő nem megfelelő eredményeket eredményezhet.

Speciális követelmények

Nincs.

Feladási idő

Három-öt munkanap a tárgylemezek és paraffinblokkok esetében.

1. Umar A, Boland CR, Terdiman JP et al. Revised Bethesda Guidelines for Hereditary Nonpolyposis Colorectal cancer (Lynch Syndrome) and Microsatellite Instability. Journal of the National Cancer Institute 2004;96(4):261-268.
2. De la Chapelle A, Hampel H. Clinical Relevance of Microsatellite Instability in Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology 2010;28(20):3380-3387.
3. Bacher JW, Flanagan LA, Smalley RL et al. Development of a fluorescent multiplex assay for detection of MSI-High tumors. Disease Markers 2004; 20:237-250.
4. Murphy KM, Zhang S, Geiger T et al. Comparison of the Microsatellite Instability Analysis System and the Bethesda Panel for the Determination of Microsatellite Instability in Colorectal Cancers. Journal of Molecular Diagnostics 2006;8(3):305-311.
5. Anderson S, Bloom KJ, Vallera DU et al. Multisite Analytic Performance Studies of a Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of BRAF V600E Mutations in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Specimens of Malignant Melanoma. Arch pathol lab Med 2012;136(11):1385-1391.
6. Buhard O, Suraweera N, Lectard A et al. Kvázimonomorf mononukleotid ismétlődések a magas szintű mikroszatellita instabilitás elemzéséhez. Disease Markers 2004;20:251-257.
7. Patil DT, Bronner MP, Portier BP et al. A five-marker panel in a multiplex PCR accurately detects microsatellite instability-high colorectal tumors without control DNA. Diagn Mol Pathol 2012 Sep;21(3):127-33.
8. Berg KD, Glaser CL, Thompson RE et al. Detection of microsatellite instability by fluorescence mulitplex polymerase chain reaction. J Mol Diagn 2000, 2:20-28.
9. De Craene et al. A mikroszatellita-instabilitás (MSI) kimutatása vastagbélrák mintákban új, nagy érzékenységű markerekkel az IdyllaTM MSI Test prototípus segítségével. Journal of Clinical Oncology 2018; 36:15.

Frissítve 2019. május 23-án

.