Discussion

Az emberi mikrobióta több mint ezer különböző baktériumfajt tartalmaz, és fontos szerepet játszik az emberi egészségben a tápanyagellátás elősegítésével, a kórokozók kolonizációjának megakadályozásával, valamint a normál nyálkahártya-immunitás kialakításával és fenntartásával. A bélközeli baktériumokat nemrégiben úgy értékelték, mint amelyek valódi szimbiózisban állnak a gazdaszervezettel ; ezen a nagy baktériumkészleten belül a LAB (azaz Lactobacillusok és Bifidobaktériumok) tartalmú probiotikus étrend-kiegészítőkről azt állították, hogy számos kedvező hatást gyakorolnak az emberi egészségre, például a hasmenés és a gyulladásos bélbetegségek megelőzésére vagy az urogenitális fertőzések megelőzésére. Az egyes fajok és törzsek emberi egészségben és betegségekben betöltött biokémiai szerepéről azonban csak igen korlátozott ismereteink vannak. Ebben a tanulmányban az volt a célunk, hogy a nitrátban gazdag táplálékkal és a GI-traktus nyálkahártya felszínén található oxigénszintekkel kompatibilis in vitro körülmények között továbbfejlesszük az emberi bélben kolonizáló kiválasztott gyakori baktériumfajok nitrátredukciós útjainak megértését. Vizsgálatunk elsődleges eredményei azt mutatják, hogy: 1) az E.coli, egy fakultatív anaerob, a nitrátot nitritté, majd ammóniává alakítja, amely fokozatosan felhalmozódik a táptalajban; 2) a L.plantarum, egy fermentatív baktérium, exogén hem és K2-vitamin jelenlétében tenyésztve hasonló folyamatokat végez; 3) az E.coli enzimek csak anaerob körülmények között termelnek jelentős NO-t nitritből; 4) minden vizsgált LAB-kultúra nagy mennyiségű tejsavat termel, ami elegendő savasodást okoz a táptalajban ahhoz, hogy a nitrit NO-vá történő disproporcióját elősegítse.

A legtöbb eukarióta elsősorban oxidatív foszforilációval nyeri energiáját, és az ATP képződéséhez O2-t kell lélegeznie, azonban számos bélbaktérium, köztük az E.coli K12 törzsek, képesek a NO3-at alternatív elektronakceptorként használni, amikor az O2 limitáló, a nitrát pedig bőséges . Az E.coli az Enterobacteriaceae modelltagja, és bár ez a család a bél mikrobiótának csak kis hányadát teszi ki, különösen fontos, mert egyes törzsek betegségeket okozhatnak. A közelmúltban azt is kimutatták, hogy a gazdaszervezet gyulladásának melléktermékeként keletkező nitrátot az E.coli a légzés során felhasználhatja arra, hogy növekedési előnyt biztosítson és felülkerekedjen a vastagbélben élő, kizárólag fermentációra támaszkodó mikrobákon. A L. plantarumot biztonságos probiotikumnak tekintik, és általában megtalálható az emlősök bélrendszerében, valamint az emberi nyálban, ahol a nitrátok ismerten millimoláris szintre halmozódnak fel a nitrát entero-nyálciklusa miatt, amely a teljes keringő nitrát mintegy 25%-át teszi ki. Ez a baktérium a LAB család tipikus fakultatív heterofermentatív útvonalát mutatja be, de a L. plantarum WCFS1 genomjában nemrégiben azonosítottak olyan géneket, amelyek egy feltételezett nitrát-reduktáz rendszert (narGHJI) kódolnak, ami arra utal, hogy a baktérium képes a nitrátot elektronakceptorként használni . Valóban, az L.plantarum nemrég publikált genetikai elemzése rávilágított a rendkívül változatos és sokoldalú metabolikus képességére .

Kísérleteinkben mind az E.coli-ban, mind az L. plantarum-ban jelentős nitrát reduktáz aktivitást mutattunk ki, ahogy az oxigénfeszültség a légköri szintről a nulla felé csökken. Ezzel szemben a B.longum infantis, egy csecsemőkori gyomor-bél traktusból származó mikro-aero toleráns anaerob, még magas koncentrációban sem mutatott nitrát redukciós képességet. A bifidobaktériumok a csecsemő tápcsatorna baktériumainak akár 90%-át is képviselik, és eredményeink összhangban vannak azzal a megfigyeléssel, hogy az emberi anyatej, amely különösen magas nitritszintet mutat, étrendi forrást biztosít a nitrit számára, mielőtt a felnőtt flórában általában megtalálható, nitrátcsökkentésre képes nyelvi és bélmikrobióta kialakulna.

Az 1. ábrán megmutattuk, hogy az 5 mM NO3–t tartalmazó E.coli kultúrák kompetitív növekedési előnyt élveznek a nitrát hozzáadása nélküli kultúrákkal szemben, majd meghatároztuk az oxigén és nitrát gradiensek hatását a nitrit és ammónia termelésére. Eredményeink azt mutatják, hogy körülbelül 2,5 mM NO3- 4%-os vagy alacsonyabb O2 mellett elegendő a nitrátreduktáz enzimek expressziójának indukálásához, és hogy 24 óra elteltével jelentős mennyiségű nitrit halmozódott fel mind az E.coli sejtekben, mind a táptalajban. A bakteriális enzimaktivitás szabályozásának részletes molekuláris elemzése meghaladja e tanulmány kereteit, azonban jól ismert, hogy az E.coli K12 törzsek három molibdéntartalmú nitrátreduktázt expresszálnak, és hogy a volfrám az aktív helyen lévő molibdénatom helyettesítésével hatástalaníthatja ezeket az enzimeket. Megállapítottuk, hogy 300 μM volfrám-oxid hozzáadása az 1. ábrán bemutatott kísérletekhez hasonlóan tenyésztett kultúrákhoz szinte teljesen megszüntette a nitritképződést (az adatok nem láthatóak). Ezért úgy véljük, hogy a nitritképződés döntő lépéséért a molibdénfüggő nitrátreduktázok felelősek. Azt is fontos megjegyezni, hogy az E.coli, valamint számos más baktériumfaj érzékeny a nitrit-toxicitásra a fém-nitrozil-komplexek képződése miatt, és ezt a toxicitást egy nitrit-membrán transzporter és más, a nitrit redukciót közvetítő enzimek koordinált indukciójával minimalizálják. Az E.coli nitrát- és nitrit-reduktáz enzimek és operonok génjeinek, szabályozásának és expressziójának teljes leírása megtalálható Stewart és Cole kiváló publikációiban.

Nitrogén-oxidok redukciós útjai az emberi bélben

A nitrát és nitrit jelenléte a GI alsó traktusban számos tényezőtől függ, beleértve a bélben megtelepedő baktériumtípusokat és a táplálkozás és a nitrogén-oxidok metabolikus útjai közötti bonyolult egyensúlyt. Az NO oxidációjából származó nitrát endogén termelése (főként az oxi-hemoglobinnal való reakció révén) azonban már régóta ismert, hogy nagyságrenddel nagyobb, mint a táplálékkal történő bevitel, amint azt az 1970-es évek végén és a közelmúltban eNOS-hiányos egerekkel végzett vizsgálatokban kimutatták. Az 5. ábra vázlatos ábráján összefoglaltuk a bakteriális légzőszervi denitrifikáció, a nitrogén-oxidok ammóniává történő redukciója, az endogén L-arginin/NO-szintáz útvonal és a nem enzimatikus nitrit NO-vá történő redukciója közötti kapcsolatot. A denitrifikációs folyamatban (piros doboz) a nitrát nitrogéngázzá (N2) redukálódik egy négylépcsős folyamat során, amelyben a nitrit, a NO és a dinitrogén-oxid elektronakceptorok az energiatermelő reakciókban. Nemrégiben bebizonyosodott, hogy az emberi foglepedékben létezik egy teljes denitrifikációs útvonal, amely N2 termeléséhez vezet, és bár az emberben még mindig kisebb jelentőségűnek tartják, feltételezzük, hogy nagyon alacsony oxigénfeszültség mellett, nitrát jelenlétében fontos szerepe lehet, és az N2 képződését nem lehet kizárni az emberi bélrendszerben. A denitrifikáció és az ammóniává történő disszimiláló nitrátredukció (DNRA, kék doboz) osztozik az első nitrát-nitrit redukciós lépésben, és a nitrátreduktázok számos osztályát hozták kapcsolatba ezzel a reakcióval. A DNRA-ban a második lépés a közvetlen nitritből ammóniává történő hat elektronos redukció, amely nem szolgáltat energiát, de meglehetősen gyakori méregtelenítési folyamat a fakultatív anaerob baktériumokban. A DNRA az emlősök bendőjében a nitrátanyagcsere fő útvonalának tekinthető. Ez a tanulmány az ammóniát a nitrátredukció termékeként azonosította E.coli és Lactobacilli baktériumokban, amelyeket mM nitrát jelenlétében, 4%-os oxigénszint mellett vagy annál alacsonyabb szinten tenyésztettek.

Expand

A légúti denitrifikáció is képes kis, de jelentős mennyiségű NO-t termelni köztes termékként, és szerepet játszott a bél bakteriális NO-termelésében . További lehetséges NO-termelő útvonalak a nitrit savas átalakulása (zöld doboz) és az L-arginin oxidációja a NOS enzimek által (barna kör). A 4C ábrán megvizsgáltuk a nitrit nem enzimatikus disproporciójának protonfüggését, és kimutattuk, hogy ez csak akkor válik relevánssá, ha az intracelluláris vagy a testnedvek pH-ja 5,5-nél alacsonyabb. Eredményeink az E.coli és a L.plantarum aktív NOS enzimek jelenlétét is kizárták, azonban a bélhámsejtek köztudottan termelnek NO-t mind az endoteliális, mind az indukálható NOS izoformák expressziója révén. Érdekes módon az NO-termelődést a bélben a bélnyálkahártya sejtjein nagy mennyiségben előforduló peroxidázok enzimatikus folyamatai is kiválthatják, amelyekről kimutatták, hogy antibakteriális hatásuk részeként nitritet használnak szubsztrátként NO előállításához.

Úgy véljük, hogy mindezek a különböző nitrátredukciós útvonalak egyidejűleg létezhetnek és fordulhatnak elő, azonban valószínű, hogy csak az egyik metabolit dominálna az adott fiziológiai körülményektől függően.

A bakteriális nitrátredukcióval történő NO-képződés élettani jelentősége

A táplálékkal bevitt nitrátot és nitritet számos tanulmányban még mindig lehetséges toxikus anyagként képzelik el, annak ellenére, hogy egyre több bizonyíték van arra, hogy az ezekből az ionokból történő NO-termelés fontos jótékony hatással van a szív- és érrendszeri, immunrendszeri és gasztrointesztinális funkciókra . A bélben az NO számos élettani funkciót lát el, például a nyálkahártya véráramlásának, a bélmozgékonyságnak és a nyálka vastagságának szabályozását. Az NO krónikus túltermelését a gyulladásos bélbetegségekkel is összefüggésbe hozták, és valószínűleg számos baktériumfaj növekedését gátolja. Korábbi vizsgálatok nem hagyták tisztán, hogy a bélbaktériumok hogyan termelik a NO-t. Sobko és munkatársai azonban kimutatták, hogy a hagyományos patkányokkal ellentétben a csíramentes patkányok bélrendszerében a NO-szint rendkívül alacsony, és normál baktériumflórával beoltva a megfigyelt NO-termelés 10-szeresére nőtt.

Kísérleteinkben az oxigén- és protonkoncentráció határozta meg a nitrát NO-vá történő redukciójának specifikus útját. A 4A. ábrán bemutatott eredmények azt mutatják, hogy az E.coli képes enzimatikus NO-aktivitásra anaerob körülmények között, 1 mM-nál nagyobb nitrátkoncentráció mellett, valószínűleg denitrifikáción vagy a periplazmatikus citokróm c nitrit reduktáz enzimen (Nrf) keresztül, ahogy azt Corker és Poole javasolta . Ez az NO-termelés azonban 2%-os oxigénszint mellett jelentősen csökken, és nitrátfüggetlenné válik. Fontos, hogy adataink összhangban vannak Sobko és munkatársai jelentésével, miszerint az E. coli jelentéktelen NO-szintet termelt 24 órás inkubáció során 0,1 mM nitrát mellett . A LAB jelentős mennyiségű NO-t termelt a közeg savasodására válaszul a tejsav felhalmozódása miatt. A táptalaj friss LMRS-sel (pH = 6,5) való helyettesítése szinte teljesen blokkolta a LAB-kultúrák azon képességét, hogy a nitritet NO-vá alakítsák, de az E.coli esetében nem. A bél pH-értékének mérései 5,7 és 7,5 között mozognak, így az in vivo nitrit-diszproporció valószínűleg a NO-termelés egy kisebb és lokalizált aspektusa. Ezzel szemben ez az útvonal a gyomor savas környezetében (pH kb. 3) jól ismert jelenség.

Összefoglalva azt sugalljuk, hogy a bélnyálkahártya közelében a bélbaktériumok által termelt NO vagy a fent említett jótékony hatásokat fejti ki, vagy magasabb szinteken zavarhatja ezeket a funkciókat. Így a bakteriális NO-képződés a bélben mind az élettani, mind a kóros hatások modulátorának tekinthető.

A bakteriális ammóniaképződés élettani következményei az egészségre

A kolonbaktériumokról Vince és munkatársai 1970-es évek elején végzett alapvető vizsgálatai óta ismert, hogy aminosav-deaminálásból vagy ureázon keresztül, a karbamid szén-dioxiddá és ammóniává történő hidrolízisével ammóniát termelnek . Nemrégiben Cole és munkatársai arról számoltak be, hogy az E.coli-ban a nitrit redukció fő terméke az ammónia, és semleges pH-n csak kb. 1%-a redukálódik NO-vá . A vizsgálatunkban kapott eredmények arra utalnak, hogy legalábbis bizonyos gyakori bélbaktériumok elsősorban ammóniává, nem pedig NO-vá redukálják a nitritet. Egészséges személyeknél, rendes élettani körülmények között, az alsó tápcsatornában keletkező ammónia nagy része a testnedvekkel ürül ki, majd a máj hepatocitáiban metabolizálódik, ahol az ammónia és a szén-dioxid enzimatikusan karbamoil-foszfáttá alakul, amely a “karbamidciklusnak” nevezett reakciósorozatba lép, amely karbamidképződéshez és annak a vese általi eltávolításához vezet (lásd az 5. ábrát). Az ammónia normális plazmakoncentrációja 10-35 μM között van, azonban túlzott ammóniatermelés esetén a portális vérben lévő ammónia megkerülheti a májat, ami hiperammonémiához vezet. A vérben lévő ammónia szabadon áthatol a vér-agy gáton, és a magas szintek (>100 μM) toxikus hatással vannak a központi idegrendszerre, ami enkefalopátiához és végül kómához vezet. A májcirrózisban szenvedő betegeknél nagyon gyakran alakul ki hepatikus enkefalopátia (HE) . Májelégtelenség hiányában a hiperammonémiás kómát ureázképes mikroorganizmusok, például Klebsiella pneumonia által okozott szepszisnek tulajdonítják. A HE klasszikus terápiás megközelítései közé tartozik a szisztémás ammóniaszint csökkentése antibiotikus kezeléssel (a bélrendszeri ammóniát termelő baktériumok elpusztítása érdekében) és nem felszívódó cukrok, például laktulóz és laktitol adása. A vastagbélben a laktulóz a vastagbélbaktériumok hatására elsősorban tejsavvá, valamint kis mennyiségű hangyasavvá és ecetsavvá bomlik le. Ez a savasodás elősegíti a nem felszívódó ammóniumion ammóniából történő képződését, és csökkenti annak koncentrációját a plazmában. Nem világos, hogy a táplálékkal bevitt nitrát milyen mértékben járul hozzá a bélben és a vérben lévő ammóniakoncentrációhoz, azonban azt az alternatív hipotézist javasoljuk, hogy a vastagbéltartalomnak a laktulóz jelenléte miatti fokozott savasodása az ismert savfüggő mechanizmus révén kedvez a mikrobiota nitrit NO-vá történő átalakulásának az ammónia helyett.

Következtetések

Az exogén nitrát biológiai sorsáról több mint 30 évig nem lehetett számot adni a kiválasztódó nitrogéntartalmú vegyületekben, amelyek az emberben bevitt nitrátdózis mintegy 60%-át teszik ki. Eredményeink alátámasztják azt az elképzelést, hogy a nitrátot a nyálban, a gyomorban, a vékony- és vastagbélben lévő baktériumok nitritté, majd más redukált nitrogén biomolekulákká, például NO-vá, ammóniává, karbamiddá és esetleg nitrogéngázzá alakítják. Az olyan kérdések, mint például, hogy mennyi ammónia keletkezik a nitrát-nitrit redukcióból, szemben más fontos folyamatokkal, mint például a deaminálás és a bakteriális ureázok aktivitása, részletes anyagcsere-vizsgálatokat igényelnek állatokon és/vagy embereken. A táplálékkal bevitt nitrátok béllumenben történő átalakulásának biológiai jelentőségét még meg kell állapítani. Mindazonáltal a hagyományos japán és mediterrán étrendben, amelyről ismert, hogy szív- és érrendszeri védőhatással bír, az egy főre jutó átlagos nitrátbevitel 2-3-szor magasabb, mint a tipikus nyugati étrendben (az Egyesült Államokban ez körülbelül 40-100 mg/nap nitrátnak felel meg). A szimbiotikus baktériumok, a nitrogén-oxidok anyagcseréje és az emberi egészség közötti kapcsolat további vizsgálatára van szükség; az azonban világos, hogy az emlősök nitrogén-anyagcseréjének biológiai útjai sokkal összetettebbek és fontosabbak, mint azt még néhány évvel ezelőtt elképzelték.

.