Eredmények és értekezés
A BRAFV600E mutáció miatt konstitutívan aktivált MAPK-val rendelkező A375 melanomasejtvonalat 25 μM koncentrációjú U0126 MEK-inhibitorral kezeltük 8 órán keresztül, ami az ERK foszforiláció elnyomását eredményezte (1. a ábra). Az immunszuppresszív szolubilis faktor mRNS-ek, köztük az IL-6, IL-10 és VEGF, jelentősen csökkentek az U0126 kezelés hatására (1. b ábra), míg a kontroll DMSO kezelés nem befolyásolta az IL-10 és VEGF mRNS termelését, és csak kismértékben növelte az IL-6 mRNS szintjét. A 18 órás U0126-expozíció fehérjeszinten is elnyomta az IL-10, VEGF és IL-6 termelését, ami arra utal, hogy az aktivált ERK-k felelősek lehetnek a melanoma elleni helyi immunválaszok elnyomásáért azáltal, hogy ezeket az immunszuppresszív faktorokat termelik (1. ábra c). Ezenkívül az ERK-foszforiláció elnyomása és az IL-6, IL-10 és VEGF termelésének gátlása az U0126 kezelés koncentrációjának 10 μM-ra való csökkentése után is bekövetkezett (nem ábrázolva). A vizsgálat során az A375 sejtek U0126 kezelésével nem észleltünk jelentős citotoxikus hatást. Bár az U0126-ról ismert, hogy a MEK1/2 mellett a MEK5-öt is gátolja, a foszforilált ERK5, a MEK5 szubsztrátja nem volt kimutatható az A375-sejtekben (nem ábrázolva), ami arra utal, hogy a MEK1/2-ERK1/2 útvonal felelős az U0126-kezeléssel megfigyelt hatásokért. Az U0126 IL-10 és VEGF-termelésre gyakorolt szuppresszív hatását három másik BRAFV600E mutációval rendelkező melanoma-sejtvonalon, a 624mel, 888mel és 928mel is kimutattuk, jelentős sejttoxicitás nélkül (1. ábra d). Mivel ezek a melanoma-sejtvonalak nem termelnek IL-6-ot, úgy tűnik, hogy az aktivált MAPK jelátvitel általános szerepet játszik az IL-10 és a VEGF immunszuppresszív faktorok termelésében a BRAFV600E+ melanoma-sejtvonalakban.
A BRAFV600E mutáción keresztül konstitutívan aktív MAPK-val rendelkező melanoma-sejtvonalakból származó IL-6, IL-10 és VEGF immunszuppresszív szolubilis faktorok termelésének csökkenése a MAPK-szignalizáció MEK-gátlóval, az U0126-val történő gátlásával. (a) Az ERK1/2 foszforilációjának gátlását Western blot analízissel mutattuk ki a BRAFV600E mutációval rendelkező A375mel melanoma sejtvonalon a 25 μM koncentrációjú U0126 MEK-inhibitorral történő kezelés előtt, valamint 2, 4, 6 és 8 órával azt követően. (b) Az IL-6, IL-10 és VEGF immunszuppresszív szolubilis faktorok mRNS-expressziójának gátlása az A375 sejtekben. A különböző szolubilis faktorok, köztük az IL-6, IL-10 és VEGF mRNS-eit kvantitatív RT-PCR-rel mértük az U0126-os kezelés előtt és 2, 4, 6 és 8 órával azt követően. A kontroll kezelést DMSO oldattal végeztük. Az egyes időpontokban mRNS-szinteket a GAPDH mRNS-hez normalizáltuk, és a 0 h-hoz viszonyított relatív értékként jelöltük. (c) Az IL-6, IL-10 és VEGF fehérjék csökkent termelése az A375 sejtekből az U0126 25 μM koncentrációjú 18 órás kezelését követően. Az expressziót ELISA-val detektáltuk a tenyésztési felülúszóból. Az U0126-tal kezelt sejtek DMSO-val kezelt sejtek életképességének aránya a betakarításkor 77% volt. A citokintermelést a sejtek száma alapján a kontroll DMSO-val kezelt sejtek értékéhez normalizáltuk. A Western blot az ERK foszforiláció erős gátlását mutatta, de nem a STAT3 fehérje, illetve annak Ser727 és Tyr705 foszforilációját. (d) Három BRAFV600E mutációval rendelkező melanoma sejtvonal, a 624mel, a 888mel és a 928mel IL-10 és VEGF termelésének csökkenése az U0126 25 μM koncentrációjú 18 órás kezelését követően, amelyet a tenyésztési felülúszókból ELISA-val mutattunk ki. Az U0126-tal kezelt sejtek DMSO-val kezelt sejtek életképességének aránya a betakarításkor 95% volt a 624mel, 103% a 888mel és 100% a 928mel esetében. A citokintermelést a sejtek száma alapján a kontroll DMSO-val kezelt sejtek értékéhez normalizáltuk. A Western blot az ERK foszforiláció erős gátlását mutatta, de a STAT3 fehérje gátlását nem. A STAT3 Ser727 foszforilációjának enyhe csökkenését figyeltük meg a 888mel és 928mel sejtekben, de a 624mel sejtekben nem. Ezek az eredmények három vagy négy független kísérletre reprezentatívak, hasonló eredményekkel.
Az U0126-nak a citokintermelésre a MAPK jelátviteli útvonalakon kívüli, nem specifikus hatása azonban nem zárható ki teljesen ezekből a kísérletekből, mivel a 888mel és 928mel sejtekben a STAT3 Ser727-es foszforilációjának enyhe csökkenését figyelték meg (1. ábra d). A BRAFV600E mutáció miatt aktivált MAPK szerepének megerősítésére az IL-10, VEGF és IL-6 termelésében BRAFV600E-specifikus RNSi-t transzfektáltunk három melanoma sejtvonalba, A375, 888mel és 624mel, BRAFV600E-specifikus rövid hajtű RNS-t (shRNS) expresszáló lentivírus segítségével (11). A BRAFV600E-specifikus RNSi jelentősen gátolta az IL-10, VEGF és IL-6 termelést, valamint elnyomta az ERK foszforilációt (2. ábra). Ezek az eredmények megerősítik, hogy e faktorok U0126 általi gátlása (1. ábra) a MAPK-útvonal specifikus gátlásával korrelál. Ezek az eredmények összhangban vannak a közelmúltban megjelent publikációkkal, amelyek az ERK1/2 által indukált IL-10 termelést mutatták ki egér makrofágokban (12) és a BRAFV600E-függő VEGF-termelést az angiogenezis elősegítésére (13).
A BRAFV600E-mutációval rendelkező három melanoma-sejtvonalból származó IL-6, IL-10 és VEGF immunszuppresszív faktorok termelésének csökkenése BRAFV600E-specifikus RNSi által. A három BRAFV600E mutációval rendelkező melanoma-sejtvonalat, az A375mel, a 888mel és a 624mel-t, 50 vagy 100-as fertőzési multiplicitással megfertőztük a szentjánosbogár luciferáz mRNS-t (GL3B; mint kontroll) vagy a BRAFV600E mRNS-t (BRAF#1′) kódoló rövid hajtű RNS-t tartalmazó lentivírusvektorokkal. A fertőzést követő 5 vagy 6 d után fehérjéket extraháltunk és Western blot analízisnek vetettük alá. A BRAFV600E-specifikus RNSi hatására az ERK1/2 foszforilációjának jelentős csökkenését figyeltük meg a BRAF-fehérje csökkenésével együtt. A STAT3 fehérje és a STAT3 Ser727 vagy Tyr705 foszforilációjában nem észleltünk szignifikáns különbséget. A 888mel és 624mel sejtekben a Ser727 foszforiláció enyhe csökkenését figyeltük meg a BRAF RNAi után. A lentivírus-fertőzést követően 5 vagy 6 nappal a melanomasejtek azonos számát 1-2 × 106 sejt/2 ml sűrűségben adagoltuk, és a tenyésztési felülúszókat 18 óra elteltével IL-6, IL-10 vagy VEGF ELISA-vizsgálatnak vetettük alá. Az IL-6, az IL-10 és a VEGF jelentős csökkenését figyeltük meg. Két vagy három független, hasonló eredményt mutató kísérlet egy-egy reprezentatív eredménye látható.
Mivel az aktivált STAT3 jelátvitelről megállapították, hogy különböző faktorok, köztük a VEGF termelésén keresztül a rákból származó immunelkerüléshez vezet (8, 9), megvizsgáltuk a MAPK és a STAT3 útvonalak közötti kapcsolatot az A375 melanoma sejtvonalban az immunszuppresszív faktorok termelését illetően. Az IL-6, IL-10 és VEGF termelését mélyen gátolta a BRAFV600E-t vagy csak a STAT3-at célzó RNSi (3. a ábra). A BRAF-MAPK és a STAT3 útvonalak egyidejű korlátozásával nem volt egyértelmű additív vagy szinergista hatás (3. a ábra). A BRAFV600E RNSi az A375 sejtekben nem csökkentette a STAT3 DNS-kötő aktivitását (3. b ábra), a STAT3 promóter aktivitását (3. c ábra) vagy a STAT3 foszforilációját sem a Ser727-nél, sem a Tyr705-nél (2. ábra), bár az ERK-ról azt jelentették, hogy potenciálisan képes a STAT3 foszforilálására a Ser727-nél (14). A STAT3 foszforilációja azonban ERK-független útvonalon is bekövetkezhet (15). A 624mel sejtekben, bár a Ser727-foszforilált STAT3 enyhe csökkenését tapasztaltuk, a BRAFV600E RNAi nem befolyásolta a DNS-kötő aktivitást (3. b ábra) és a STAT3 promóteraktivitást (3. c ábra) (2. ábra). A 888mel sejtekben hasonlóan csökkent a Ser727 foszforiláció, de fordítva, mind a STAT3 DNS-kötő aktivitása (3. b ábra), mind a STAT3 promóter aktivitása (3. c ábra) csökkent a BRAFV600E RNAi után (2. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy nem a STAT3 transzkripciós aktivitásának csökkenése a fő mechanizmus, amely az immunszuppresszív faktorok elnyomását a MAPK-szignalizáció down-regulációjával generálja ezekben a melanoma-sejtvonalakban.
A375 sejtekben az IL-6, IL-10 és VEGF termelésének gátlása csak a BRAFV600E, csak a STAT3 vagy mindkettő RNSi révén, a STAT3 DNS-kötő és promóter aktivitásának jelentős változása nélkül. (a) Az IL-6, IL-10 és VEGF termelésének mélyreható gátlása A375 sejtekben a BRAFV600E-re önmagában, a STAT3-ra önmagában vagy mindkettőre vonatkozó RNSi révén. A fertőzés után 5 vagy 6 nappal azonos számú sejtet 106 sejt/2 ml sűrűségben adagoltunk, és a tenyésztési felülúszót 18 óra elteltével ELISA-nak vetettük alá IL-6, VEGF és IL-10 kimutatására. A BRAF és a foszforilált ERK1/2 csökkenését a BRAFV600E-specifikus RNSi és a STAT3 csökkenését a STAT3-specifikus RNSi által Western blot analízissel igazoltuk. Hat hasonló eredményt mutató független kísérlet egy reprezentatív eredménye látható. (b) A STAT3 DNS-kötő aktivitás nem változott jelentősen a MAPK jelátvitel BRAF RNSi-vel történő gátlásával melanoma sejtvonalakban. A STAT3 DNS-kötési aktivitást melanoma-sejtvonalakból származó magkivonatok EMSA-val vizsgáltuk kontroll GL3B vagy BRAF#1′ shRNS vektoros kezelés mellett. A nyilakkal jelzett specifikus STAT3 sávok eltűntek a hideg vad típusú STAT3 DNS-szondával (wt), de a mutáns STAT3 DNS-szondával (mt) nem. A 888mel sejtekben csak a STAT3 DNS-kötő aktivitás enyhe csökkenése volt megfigyelhető. (c) STAT3 riportervizsgálatok A375, 624mel és 888mel sejtekben. 2-4 × 105 kontroll vagy BRAF#1′ shRNS vektorral fertőzött sejtet transzfektáltunk 0,4 μg pSTAT3-TA-Luc és 0,4 μg pRL-SV40 sejtekkel Effectene transzfekciós reagenssel. A transzfekció után 24 órával a sejteket learattuk, és elemeztük a szentjánosbogár- és renilla luciferáz aktivitást. Minden egyes szentjánosbogár luciferáz aktivitást a renilla luciferáz aktivitással normalizáltunk. Az árnyékolt sávok és a hibasávok a háromszoros vizsgálatok átlagát, illetve standard eltérését jelzik. Három vagy négy független kísérlet egy-egy reprezentatív kísérlete látható. A STAT3 által vezérelt transzkripció nem változott a BRAF RNAi után az A375 és a 624mel esetében, de a 888mel esetében enyhén csökkent.
A következőkben az A375 kultúrák felülúszójában a MAPK és STAT3 jelátvitel által indukált oldható faktorok által okozott lehetséges hatásokat vizsgáltuk a DC-k érésére. A tenyésztett A375 melanomasejtek felülúszója olyan oldható faktorokat tartalmaz, amelyek gátolják a humán monocitákból származó DC (MoDC) érését, amikor Toll-szerű receptor ligandumokkal, például LPS-szel stimulálják őket. Az A375 tenyésztési felülúszó 10-20%-os végső koncentrációban történő hozzáadása a MoDC-kultúrákhoz jelentősen csökkentette a gyulladásos citokinek, köztük az IL-12 és TNF-α termelését a MoDC-kben, valamint a CD1a és CD83 sejtfelszíni molekulák, de nem a CD80, CD86, CD40 vagy HLA-DR termelését a MoDC-ken. A másik három melanoma-sejtvonalból származó felülúszók a MoDC-kultúrákhoz adva ugyanezeket az eredményeket hozták (nem ábrázolva). A melanoma sejtek felülúszóinak szuppresszív aktivitása az IL-6, IL-10 és VEGF termeléséből származik, mivel az ezen faktorokra specifikus antitestek hozzáadása csökkentette az A375 kultúra felülúszóinak szuppresszív aktivitását (4. a ábra). A megfigyeléseink és a korábban közölt, az MHC II. osztály és a CD40 expresszióját gátló aktivált STAT3-mal rendelkező egér B16 melanoma sejtek szupernátriumára vonatkozó eredmények közötti eltérések az eltérő tumorsejtekkel vagy fajokkal magyarázhatók (8).
A375 melanoma tenyésztési felülúszók szuppresszív aktivitásának csökkenése a BRAFV600E-re önmagában, a STAT3-ra önmagában vagy mindkettőre vonatkozó RNSi előkezeléssel a DC-k LPS-indukált IL-12 és TNF-α termelésére. (a) Az IL-6, IL-10 vagy VEGF semlegesítése az A375 melanomasejtek tenyésztési felülúszójában helyreállította az LPS-stimulált humán DC-k IL-12-termelésének gátlását. Humán MoDC-ket tenyésztettünk A375 felülúszókkal az IL-6, IL-10, VEGF monoklonális antitest vagy 1 μg/ml izotípusos kontroll antitest jelenlétében vagy hiányában. Az IL-12 termelést a tenyésztési felülúszókban ELISA-val határoztuk meg 24 órával a 100 ng/ml-es LPS-stimulációt követően. (b) A CD14+ monocitákat a PBMC-kből MACS segítségével izoláltuk, és RPMI 1640, 10% (vol/vol) FBS-t, 100 ng/ml GM-CSF-et és 50 ng/ml IL-4-et tartalmazó médiában tenyésztettük a 3. ábrán előállított A375mel sejtek 20% (vol/vol) tenyésztési felülúszójával vagy anélkül. (a) A médiumok, a citokinek és a tenyésztési felülúszó felét 2 d-enként cseréltük. 5. napon a tenyésztés során 100 ng/ml LPS-t adtunk hozzá. 15 óra elteltével a tenyésztési felülúszókat összegyűjtöttük, és az IL-12 és a TNF-α ELISA-jának vetettük alá.
Az A375 tenyésztési felülúszók LPS-kezelt MoDC-k IL-12 és TNF-α termelését elnyomó hatását helyreállítottuk, ha az A375 sejteket vagy csak a BRAFV600E-t, csak a STAT3-at vagy a BRAFV600E-t és a STAT3-at egyaránt célzó RNAi-val előkezeltük (4. ábra b). Bár úgy tűnt, hogy a STAT3 RNAi jobban csökkentette az A375 tenyésztési felülúszók szuppresszív aktivitását, mint a BRAFV600E RNAi, a különbséget egyszerűen az eltérő RNAi aktivitás okozhatta. Fontos azonban megjegyezni, hogy a BRAF-ot és a STAT3-at egyidejűleg célzó RNAi nem mutatott additív és szinergista hatást; ami ismét azt jelzi, hogy mindkét jelátviteli útvonal alapvető szerepet játszik a DC érésére ható szuppresszív faktorok termelésében. Bár már beszámoltak a DC-k aktiválásáról a STAT3 domináns-negatív formájával transzfektált egér CT26 vastagbélrák-sejtvonalból származó felülúszóval, valószínűleg a proinflammatorikus citokinek fokozott termelésén keresztül, ebben a vizsgálatban nem figyeltük meg a DC-k aktiválását. Ennek magyarázata lehet a BRAF és a STAT3 nem teljes gátlása, a BRAF shRNS-transzfektált melanomasejtekben nem volt fokozott proinflammatorikus citokintermelés, illetve a tumorsejtek vagy fajok közötti különbségek.
Összefoglalva, most először mutattuk ki a MAPK jelátvitel alapvető szerepét a STAT3 útvonallal együtt a különböző immunszuppresszív faktorok termelésében a gyakori BRAFV600E mutáció miatt konstitutívan aktív MAPK-val rendelkező melanomasejtvonalakban. Így a MAPK útvonal potenciálisan jelentős molekuláris célpont lehet a különböző rákos megbetegedések immunelkerüléseinek leküzdésében, mivel számos rákos megbetegedésben, így a BRAFV600E mutáció nélküli melanomában is gyakran aktiválódik (16, 17).