1.4.3.2 Szúnyogok
A szúnyogok olyan súlyos emberi betegségek vektorai, mint a malária, a dengue-láz és a sárgaláz, és az ellenőrzésükre tett erőfeszítések ellenére továbbra is komoly problémát jelentenek. A szaglásban, vérrel való táplálkozásban, emésztésben, szaporodásban, immunitásban stb. szerepet játszó új szúnyoggének azonosítása várhatóan megalapozza a szúnyogpopulációk és a szúnyogok által terjesztett betegségek ellenőrzésére szolgáló új módszerek kifejlesztését (Chen et al.,
A három fő szúnyogvektor, az Anopheles gambiae, az Aedes aegypti és a Culex pipiens quinquefasciatus (http://www.vectorbase.org/) genomszekvencia-információit a közelmúltban összehasonlító genomikai és transzkripciós profilalkotó vizsgálatokhoz használták fel, amelyek lehetővé teszik az új szúnyoggének nagy tömegeinek azonosítását. Az RNAi gyorsan vált a génfunkció jellemzésének választott eszközévé a szúnyogbiológia és a szúnyog-patogén kölcsönhatások különböző területein (pl. Fragkoudis és mtsai., 2009). Ennek eredményeképpen meglehetősen sok funkcionális RNAi-tesztet publikáltak ebben az élőlénycsoportban, beleértve az aedines (A. aegypti, Armigeres subalbtus és C. pipiens) és az anophelines (A. gambiae és Anopheles stephensi) tagjait. E tanulmányok többsége azonban csak két fajra összpontosított: a dengue és a sárgaláz fő vektorára, az A. aegyptire, valamint a malária afrikai vektorára, az A. gambiae-re (1.1. táblázat).
Ezekben a vizsgálatokban a tipikus kísérleti stratégia a dsRNS mikroinjekcióját tartalmazta a kifejlett szúnyogok mellkasába, amelyet táplálkozás, kórokozókkal, szaganyagokkal, rovarölő szerekkel vagy stresszhelyzetekkel való kihívás, majd a szúnyogok későbbi vizsgálata követett, hogy elemezzék a célzott gén elnémításának fenotípusos hatását a vizsgált fiziológiai folyamatra, beleértve a szaglást, táplálkozást, emésztést és anyagcserét, stresszt, méregtelenítést, kutikulaképződést, szaporodást, immunitást és diapauza szabályozását. A következőkben bemutatunk néhány reprezentatív tanulmányt a szúnyogokon végzett RNAi vizsgálatokról.
A szaglás mind a kifejlett, mind a lárva szúnyogok viselkedésének széles skáláját közvetíti, beleértve a táplálkozást, a gazdapreferenciát, a párkeresést/kiválasztást és a tojásrakási helyek szaporodását. A szaglás magában foglalja az illatanyagmolekulák által nyújtott kémiai ingerek érzékelését és az ilyen ingerekre adott specifikus válaszok kialakulását. Az illatanyagokat az illatanyag-kötő fehérjék (OBP) fogják fel, amelyek a szaglóneuronok dendritikus membránjain lévő illatanyag-receptorokhoz (OR) szállítják őket. A közelmúltban mind az OBP, mind az OR gének RNSi célzása értékes információkkal szolgált a szaglás mechanizmusában és specifitásában betöltött funkciójukról (Biessmann et al., 2010; Liu et al., 2010; Pelletier et al., 2010), ami lehetőséget nyit a szaglásérzékelés és ezáltal egy sor olyan viselkedésmód módosítására, amely a szúnyogcsípés és a párosodás megelőzését eredményezheti.
A mérsékelt éghajlaton a kifejlett nőstény szúnyogok diapauzában telelnek át, egy olyan nyugalmi időszakban, amelyet a gazdakereső viselkedés hiánya, a hatalmas zsírtartalékok felhalmozódása és a petefészek fejlődésének leállása jellemez. E nyugalmi időszak szabályozásának manipulálása például nyugalmi állapotban lévő, gazdát nem kereső szúnyogok indukálását eredményezheti. Dr. Denlinger csoportjának több tanulmánya is ezt példázza. Különösen a közelmúltban használtak RNSi-t a C. pipiensben a diapause mechanizmusának vizsgálatára, hogy bizonyítsák az inzulin/FOXO jelátviteli útvonal részvételét a diapause szabályozásában (Sim és Denlinger, 2008, 2009a). Bizonyították továbbá egyes zsírsavszintázok részvételét a zsírtartalékok felhalmozásában a telelő nőstényekben (Sim és Denlinger, 2009b), valamint az S3 és S2 riboszómális fehérjék szerepét a tüszőfejlődésben a nem diapauzáló nőstényekben (Kim és Denlinger, 2010; Kim et al., 2010).
A szúnyogokban RNSi segítségével jellemezték a vitellogenezist és a szaporodást is. A kullancsok helyzetéhez hasonlóan az anautogén szúnyogoknak is gerinces gazdaszervezet vérének bevitelére van szükségük a tojástermeléssel járó szaporodási ciklus beindításához. A vérlisztből származó aminosavakat (AA) a szúnyog zsírtestében a vitellogenezisnek nevezett folyamat során sárgatestfehérje-prekurzorok, főként vitellogenin (Vg) szintézisére használják fel. A Vg ezután a hemolimfába kerül, majd a petefészkek felveszik és egy specifikus VgR-en keresztül a fejlődő petesejtekbe rakódik.
Az A. aegypti szúnyogban a Vg gének expresszióját Dr. Raikhel csapata intenzíven tanulmányozta egy hosszú, elegáns kísérletsorozatban, amelyben az RNAi-t a fordított funkcionális genomika eszközeként használták. Ez a kutatócsoport kimutatta, hogy a Vg gén átírását több molekula, köztük a szteroid hormon 20-hidroxi-ecdizon (20E) kaszkád és a táplálkozási AA/Target-of-Rapamycin (TOR) jelátviteli rendszer együttesen szabályozza. Ez a szerin/treonin kináz felelős az AA jel továbbításáért, aktiválva az S6 kináz foszforilációját, amely a transzlációs események aktiválásához szükséges (Park és mtsai., 2006; Roy és Raikhel, 2011). Továbbá, egy specifikus antagomir befecskendezésével ugyanez a kutatócsoport a miRNSi miR-27 RNS-mediált depletióját állította elő, hogy bizonyítsa a miR-27 pozitív szabályozó funkcióját mind a vérképzésben, mind a petesejtfejlődésben. Valójában a miR-27 önmagában a 20E és az AA/TOR útvonalak által szabályozott (Bryant és mtsai., 2010).
A szúnyogvektorok veleszületett immunrendszere a kórokozó felismerésében részt vevő gének három funkcionális kategóriáját, a jelerősítést, modulációt és transzdukciót közvetítő jelátviteli útvonalakat és a kórokozó gazdaszervezetből való eltávolítását közvetítő effektor mechanizmusokat foglalja magában (Baton és mtsai., 2008). Az RNSi önmagában is fontos vírusellenes immunmechanizmus a szúnyogokban. Az RNS-alapú antivirális immunitásban a vírus dsRNS-ét a szúnyog Dicer-je felismeri és siRNS-ekké dolgozza fel. Ezt követően ezek a vírusból származó siRNS-ek irányítják a specifikus vírusellenes immunitást az RNSi és a kapcsolódó RNS-csendesítő effektormechanizmusok révén (Ding, 2010). Számos közlemény számol be az RNAi alkalmazásáról a szúnyogok immungénjeinek működésének jellemzésére. Az általános immunmechanizmusokkal és effektorokkal kapcsolatos vizsgálatok a mintafelismerő receptorokra, az antibakteriális és antifungális jelátviteli útvonal molekuláira és az egyéb sejtes effektormechanizmusokban részt vevő fehérjékre összpontosítottak (áttekintés: Dong et al., 2006; Moita et al., 2005; Shin et al., 2003, 2006; Wang et al., 2006).
Az RNAi-t a szúnyog-patogén interfész jellemzésére is használták, számos vizsgálat az immunitással kapcsolatos szúnyogmolekulákat vizsgálta. A molekuláris kölcsönhatások a szúnyog-patogén határfelületen biztosítják mind a kórokozó, mind a vektor túlélését és fejlődését. Ezért a kórokozók és szúnyogvektoraik közötti molekuláris kölcsönhatások megértése alapvető fontosságú az újszerű védekezési intézkedések kidolgozásához. Az elmúlt évtizedben intenzív kutatási erőfeszítéseket tettek a kórokozó által kiváltott immunválaszokban részt vevő szúnyoggének azonosítására és funkcionális jellemzésére, különböző megközelítésekkel, többek között összehasonlító genomika, transzkripciós profilalkotás és RNAi alapú funkcionális elemzés segítségével (Baton et al., 2008). Ezek az erőfeszítések főként két szúnyog-patogén társulásra, az A. gambiae-Plasmodium sp. és az A. aegypti-dengue vírus 2 (DENV-2) társulásokra összpontosítottak. A szúnyogok arbovírusfertőzésre adott veleszületett immunválaszait Fragkoudis és munkatársai (2009) részletesen áttekintették, a maláriaparazitákra adott válaszokat pedig Brown és Catteruccia (2006) és Baton és munkatársai (2008) tekintették át nemrégiben, beleértve az RNSi megközelítéseket is.
A legtöbb ilyen RNSi-alapú vizsgálat a szúnyogok immunvédelmi mechanizmusainak génjeit vette célba, nem pedig a kórokozóknak a szúnyogvektorban való fejlődéshez szükséges géneket. Ami az RNAi knock-down-nak alávetett szúnyog-maláriaellenes géneket illeti, ezek többsége az ookinéta-ölésben és a középbélbe való behatolás során történő melanizációban részt vevő gének (áttekintve: Brown és Catteruccia, 2006; Baton et al., 2008). Ami a knock-downnak alávetett vírusellenes szúnyoggéneket illeti, egyesek jelátviteli útvonalak összetevői, míg mások az RNSi alapú vírusellenes védekezés részét képezik (áttekintve: Fragkoudis et al., 2009).
A legújabb publikációk közül Guo et al. (2010) egy hasznos megközelítést mutat be a DENV-2-vel kölcsönhatásban lévő új A. aegypti fehérjék azonosítására. Ezek a szerzők számítógépes megközelítéssel kidolgozták a szúnyogfehérje kölcsönhatási hálózat első tervezetét, és 714 feltételezett, DENV-hez kapcsolódó A. aegypti fehérjét azonosítottak, amelyek négy fő funkcionális kategóriába (replikáció/átírás/transzláció, immunitás, transzport és metabolizmus) csoportosulnak. E feltételezett DENV-asszociált fehérjék közül tíz fehérjét véletlenszerűen kiválasztottunk validálásra RNS-mediált géncsendesítéssel, és közülük öt esetében jelentősen csökkent a dengue-vírus titer a szúnyogok középbélében.
Ezek az eredmények összességében alátámasztják azt az elképzelést, hogy az RNAi hatékony eszköz lehet a rovarvektorok immunrendszerének nagy áteresztőképességű jellemzésére, hozzájárulva ezzel a potenciális szúnyogcélpontok azonosításához és jellemzéséhez a szúnyogpopulációk, a szúnyogokon belüli paraziták és a szúnyogok által terjesztett betegségek ellenőrzésére szolgáló új módszerek kifejlesztéséhez.
Miután felfedezték, hogy az RNSi a szúnyog egyik fő védekező mechanizmusa az arbovírusokkal szemben, arról számoltak be, hogy ennek az útvonalnak az elnyomása növeli a fertőzött szúnyogok vírusterhelését (Sanchez-Vargas et al., 2009). Cirimotich és munkatársai (2009) egy olyan Sindbis-vírust használtak, amelyet úgy alakítottak ki, hogy egy olyan fehérjét fejezzen ki, amely kötődik a dsRNS-hez, és feltehetően megvédi azt az RNSi útvonal feldolgozásától, ezáltal RNSi-szuppresszorként működik. Ez a módosított vírus a normálisnál sokkal több vírusrészecskét termel a fertőzött szúnyogokban, és számos szúnyogfajra (A. aegypti, Aedes albopictus, C. trithaeniorhynchus) halálos. Ez a megközelítés a genetikán alapuló új fejlesztés egyik példája, amely potenciálisan hasznos lehet a szúnyogok elleni védekezés “populációelnyomó” stratégiáiban (Alphey, 2009).
Az ellenkező cél, vagyis az RNSi alapú vírusellenes szúnyogimmunitás mesterséges fokozása a vírusrezisztens szúnyogok elérése érdekében, szintén kidolgozásra került. Az antivirális RNSi-t arra használták, hogy transzgenikus A. aegypti szúnyogokban a vírus egy fragmentumának megfelelő hajtű RNS-t expresszálva ellenállóvá tegyék őket a DENV-vel szemben (Franz és mtsai., 2009). Szövet- és időspecifikus promóterek használatával a hajtű RNS kifejeződése a középbélre – az elsőként fertőzött sejtekre – és csak a vérevés után korlátozható, minimalizálva a hosszú hajtű RNS konstitutív kifejeződéséből eredő potenciális problémákat a szúnyog fitneszére nézve. Az ilyen típusú transzgenikus rezisztens szúnyogtörzseknek a szúnyogok elleni védekezésre irányuló “populációhelyettesítő” stratégiákban való felhasználásának előnyeiről és problémáiról Alphey (2009) értekezik.
.