A nyelőcső laphámsejtes karcinóma (ESCC) és kezelése

A rák életveszélyes betegség, amely évente mintegy 8 millió halálesetet okoz világszerte. A nyelőcsőrák a rákos halálozások leggyakoribb okainak listáján a hatodik helyen áll, évente mintegy félmillió halálesethez járulva hozzá (GLOBOCAN 2012). A nyelőcsőrák különböző altípusai közül az ESCC az uralkodó szövettani típus, és igen elterjedt a kevésbé fejlett területeken, különösen Ázsia és Afrika egyes régióiban. Az ESCC-betegek számára multimodális kezelést kínálnak. A korai stádiumban lévő, reszekábilis tumorral rendelkező betegeket a tumor előzetes reszekciójával kezelik, míg az előrehaladott stádiumban lévő betegeket a sebészi reszekció előtt először kemoterápiával/ kemoradiációval kezelik a tumor stádiumának csökkentése érdekében. Bár ez a műtét előtti neoadjuváns kezelés a kemoterápiára/ kemoradiációra érzékeny betegek alcsoportjaiban kiváló választ érhet el, a betegek körülbelül egyharmada még mindig csak részleges és szuboptimális választ mutat. Még a kemoterápiára/kemoradiációra reagáló betegek egy részénél is kialakulhat rezisztencia a kezelési időszak későbbi szakaszában. Azoknál a betegeknél, akiknek a daganata nem operálható, és ha a daganat refrakter a kemo- vagy sugárterápiára, nincs hatékony kezelés . Annak érdekében, hogy a jelenlegi terápiák által nem módosítható betegek számára több kezelési lehetőséget biztosítsanak, új kezelési megközelítéseket javasolnak, és a folyamatban lévő klinikai vizsgálatokban értékelik azok daganatellenes hatékonyságát. Még mindezen fejlődő és újonnan megjelenő kezelési módok mellett is nehéz a betegség teljes gyógyítása. Ennek fényében sürgősen új kezelésekre van szükség.

A tumor xenograft állatmodellek használata a preklinikai kutatásban

A tumor xenograft állatmodellek kutatásra történő kifejlesztésének fő célja az alap- és klinikai kutatás összekapcsolása és az in vitro modellrendszerek használatának kiegészítése. A tumor xenograft állatmodellek kifinomultabb platformot biztosítanak a tumorigenezis folyamatának in vivo környezetben történő vizsgálatához. Ez a platform lehetővé teszi számunkra, hogy jobban megértsük bizonyos onkogének vagy tumorszupresszorok részvételét a tumor kialakulásában azáltal, hogy feltárjuk a kapcsolódó jelátviteli útvonalakat és a betegség mechanizmusait . Emellett ezeknek a modelleknek a használata kutatási eszközt biztosíthat számunkra a preklinikai gyógyszerreakció értékeléséhez a gyógyszer toxicitása, farmakokinetikája és farmakodinamikája mellett a daganatellenes hatékonyság meghatározásával. A gyógyszerválasz értékelésén kívül ezek a modellek megkönnyíthetik az orvosbiológiai képalkotó kutatást is, mivel modellrendszert biztosítanak az új tumor kimutatási módszerek vagy reagensek hasznosságának és gyakorlatiasságának tesztelésére.

Az egerek a leggyakrabban használt állatok a tumor xenograft modellekhez, mivel számos kulcsfontosságú előnyös tulajdonsággal rendelkeznek, mint például az emberhez hasonló genomméret, rövid szaporodási ciklus, nagy alomméret, alacsony fenntartási költség és könnyű manipulálhatóság . A rákkutatásban különböző, egyedi immunhiányos hátterű egértörzseket használnak, ezek közé tartoznak az athymic nude egerek, a SCID egerek és a NOD/SCID egerek (SCID egerek extra szintű immunhiánnyal). E törzsek közül a NOD/SCID egerek mutatják a legjobb immunhiányt, mivel szinte minden típusú immunsejt (B-sejtek, T-sejtek, dendritikus sejtek, makrofágok és természetes ölősejtek) hiányzik vagy hibásan működik, ezt követik a B-sejteket és T-sejteket nélkülöző SCID egerek, majd a T-sejtek nélküli athymic nude egerek. Az immunhiány különböző szintjei miatt a különböző törzseket különböző kutatási célokra használják. Figyelembe véve a különböző törzsek költségeit és jellemzőit, a humán tumorsejtvonalak beültetésére inkább az athymic nude és a SCID egereket használják, míg a humán tumorok transzplantációjára inkább a SCID és a NOD/SCID egereket.

Gyakran használt tumor xenograft állatmodellek ESCC-kutatáshoz

Az ESCC-kutatáshoz háromféle tumor xenograft állatmodellt fejlesztettek ki ESCC-sejtek/xenograftok vagy beteg tumorok immunhiányos állatokba történő beültetésével, nevezetesen szubkután, ortotópos és betegből származó tumor xenograft modellt (1. ábra). Mindegyiknek megvannak a maga erősségei és gyengeségei a modell jellemzői (1. táblázat), a létrehozási módszerek (2. táblázat) és a preklinikai hasznosság (3. táblázat) tekintetében, amelyek egyedi helyzetbe hozzák őket a korai, közepes vagy késői stádiumú kutatásokhoz .

.

A szubkután tumor xenograft modell

A szubkután tumor xenograft modell az ESCC kutatás klasszikus állatmodellje. Ezt a modellt úgy hozzák létre, hogy ESCC sejteket/xenotranszplantátumokat ültetnek az immunhiányos állatok bőre alá, hogy szubkután tumorok alakuljanak ki. A szubkután tumor létrehozásának eljárása technikailag egyszerű, mivel csak az ESCC-sejtek tűbefecskendezését vagy az ESCC xenograftok közvetlen beültetését jelenti az állatok bőre alá. A szubkután tumorok növekedése nem invazív módon, a tapintható tumorok mérésére szolgáló elektronikus mérőeszközzel végezhető el. A tumorok létrehozásának és nyomon követésének e technikai eljárásai fenntarthatják e modell reprodukálhatóságát és hatékonyságát (mind időben, mind költségben). Ezen előnyök ellenére a modellnek vannak bizonyos korlátai, mivel nem tükrözi teljes mértékben a klinikai helyzetet. Ez a modell például csökkentett tumorheterogenitást társít, mivel a legtöbb forgatókönyvben homogén ESCC-sejtvonalakat használnak forrásanyagként. Emellett a szubkután tumorok nem a natív tumoros mikrokörnyezetben nőnek, és ez nem teszi őket alkalmassá a tumor és a stroma közötti kölcsönhatások tanulmányozására. Ilyen erősségekkel és gyengeségekkel , ezt a modellt elsősorban a korai stádiumú kutatásokban használják az ESCC tumorigenezis biológiájának és mechanizmusának tanulmányozására.

A felhalmozódó jelentések feltárták a szubkután tumor xenograft modell alkalmazásának mérföldköveit a korai stádiumú kutatásokban azáltal, hogy az ESCC-vel kapcsolatos molekulák tumor tulajdonságainak és a kapcsolódó betegség mechanizmusainak tanulmányozására használják. A microRNS-340, egy ESCC-tumorokban lefelé szabályozott microRNS overexpressziója az EC9706 ESCC sejtekben gátolta e sejtek növekedési tulajdonságait egy szubkután tumor xenograft modellben. E mikroRNS ESCC-re gyakorolt hatását részben a PSAT1 fehérjetranszferázra gyakorolt hatásán keresztül közvetítették, amelyet ugyanebben a vizsgálatban a mikroRNS-340 közvetlen célpontjaként azonosítottak. Egy másik tanulmány a KYSE-30 ESCC sejtekből származó, az MMP1 mátrix metalloproteináz overexpressziójával rendelkező KYSE-30 ESCC sejtekből származó szubkután tumorok gyorsabb növekedését mutatta ki a kontroll sejtekhez képest. Ezenkívül ezek az MMP1-overexpresszáló ESCC-sejtek metasztatikus potenciált is mutattak. Egybehangzóan kiderült, hogy az MMP1 tumorprogressziót és áttétképződést elősegítő képessége a PI3K és AKT bevonásával zajló tumorigén útvonalra gyakorolt serkentő hatásának köszönhető. Egy külön jelentésben a szubkután tumor xenograft modellt is felhasználták, hogy felfedjék a celluláris retinsavkötő fehérje 2 (CRABP2) mint tumorszuppresszor szerepét, mivel a CRABP2-t overexpresszáló EC109 ESCC sejtekből származó szubkután tumorok lassabb növekedési sebességét mutatták ki a kontroll kísérleti csoporthoz képest . Ezek a vizsgálatok együttesen jelzik e modell hasznosságát az ESCC-vel kapcsolatos molekulák és az ESCC-vel kapcsolatos mechanizmusok tanulmányozásában.

A szubkután tumor xenograft modell tumorbiológiai tanulmányozásra történő felhasználásán kívül kísérleteket tettek e modell felhasználására az ESCC kezelésére szolgáló új kezelési módszerek vagy vegyületek/gyógyszerek tumorellenes hatékonyságának vizsgálatára. A szubkután tumort hordozó egereket olyan kezelésnek vetették alá, amely az ESCC prognosztikai marker microRNS-375 expresszióját indukálta, és a kísérlet végén a kontroll kísérlethez képest kisebb tumorméretet kaptak. Az új kezelési módszerek vizsgálatára történő rutinszerű használaton kívül ezt a modellt az ESCC elleni új vegyületek/gyógyszerek, például a jelenleg vesesejtes karcinómás betegeknél alkalmazott temszirolimusz daganatellenes hatékonyságának vizsgálatára is alkalmazták. A daganatellenes hatásvizsgálatra való hasznossága mellett ez a modell alkalmazható a vizsgált vegyületek kemo-szenzibilizáló hatásainak vizsgálatára is. A szubkután tumort hordozó állatok ginzenozid Rg3-mal, egy ginzengből kivont összetevővel történő kezelése bizonyította e vegyület két kemoterápiás gyógyszerrel, a paclitaxellel és a ciszplatinnal szembeni érzékenyítő hatását, amelyeket általában ESCC betegeknél alkalmaznak . A közelmúltban kimutatták, hogy egy új oxigénhordozó, az YQ23 szelektíven kemo-érzékenyítő hatást fejt ki a kemoterápiára rezisztens szubkután SLMT-1 ESCC xenotranszplantátumokra, de nem a kemo-érzékeny HKESC-2 ESCC xenotranszplantátumokra, ciszplatint vagy 5-fluorouracilt alkalmazó kezelési tervekben, amelyek szintén hagyományos kemoterápiás gyógyszerek, amelyeket ESCC betegeknél használnak . A fenti, a vizsgált vegyületek/gyógyszerek tumorellenes hatékonyságát önmagukban vagy az ESCC kezelésére használt gyakori kemoterápiás gyógyszerekkel kombinálva vizsgáló tanulmányok rávilágítottak a szubkután tumor xenograft modell preklinikai hasznosságára a vegyületek/gyógyszerek vizsgálatában.

A szubkután tumor xenograft modellek, különösen azok, amelyek jól jellemzettek a jelenleg ESCC kezelésére használt kemoterápiás szerekkel szembeni érzékenységük tekintetében, értékes kutatási eszközök az ESCC tumorbiológiájának és betegségmechanizmusainak in vivo tanulmányozására és preklinikai tumorellenes hatékonysági vizsgálatok elvégzésére (3. táblázat).

Orthotopikus tumor xenograft modell

Az arthotopikus tumor xenograft modell az ESCC kutatásához használt alternatív állati rákmodell. Ezt a modellt úgy hozzák létre, hogy az immunhiányos állatok nyelőcsövébe ESCC-sejteket/xenotranszplantátumokat ültetnek be, hogy ortotópos tumorok alakuljanak ki. Az ortotópos tumorok létrehozásának eljárása technikailag igényesebb, mint a szubkután tumorok létrehozásához szükséges eljárás, mivel kisállat-műtétet és/vagy altatást igényel. Az ESCC-sejtek/xenograftok állatok nyelőcsövébe történő beültetésére két fő megközelítést alkalmaznak, amelyek a tumor beültetésének helyén különböznek egymástól. Az egyik módszer az ESCC sejteket/xenograftokat a nyelőcső felső régiójába ülteti be, míg a másik módszer az ESCC sejteket/xenograftokat a nyelőcső alsó végébe, a hasi régióba, a gasztro-nyelőcső csomópont közelébe ülteti be. A közelmúltban arról is beszámoltunk, hogy összehasonlítottuk az ortotópos tumorral rendelkező állatok túlélését a nyelőcső felső és az alsó régiójában kialakult ortotópos tumorral, és megállapítottuk, hogy a hasi régióban lévő tumorral rendelkező állatok túlélése jobb. Bár az ortotópos tumorok létrehozása idő- és munkaigényesebb, ez a modell lehetővé teszi a tumor növekedésének tanulmányozását a megfelelő tumoros mikrokörnyezetben, mint a klinikai helyzetben, és lehetővé teszi a tumor és a stroma közötti kölcsönhatások tanulmányozását. Ugyanakkor a szubkután modellhez hasonló korlátozásokkal küzd azáltal, hogy a tumor létrehozásához ESCC-sejtvonalakat használnak forrásanyagként. E modell másik nagy hátránya, hogy a tumor növekedésének nyomon követéséhez speciális képalkotó módszereket kell alkalmazni, pl. az in vivo képalkotó rendszert a biolumineszcens technológia alkalmazásával párosítva. E korlátozások ellenére e modell erősségei miatt értékes állatmodellként használható a közép- és késői stádiumú kutatások során.

Bár az ortotópos tumor xenograft modell a szubkután modellel összehasonlítva kiváló előnyöket kínál, használata a fent említett korlátok miatt korlátozott marad. E hiányosságok ellenére egyre több beszámoló példázza e modell alkalmazását az ESCC tumorigenezisének tanulmányozására és preklinikai tumorellenes hatásvizsgálatok elvégzésére. Amikor ezt a modellt a DESC1 transzmembrán proteáz tumorszuppresszív hatásának feltárására használták, a DESC1-et expresszáló KYSE-150 ESCC sejtek alkalmazásával lassabb tumor növekedési sebességet figyeltek meg, mint a kontroll sejteket használó sejtekkel . Egy független vizsgálatban, amelyben ezt a modellt egy tumorral kapcsolatos fehérje-kináz AKT tumorfenotípusának vizsgálatára használták, az AKT kiütésével kapcsolatban nyilvánvaló tumorszuppresszív hatást találtak, így az ortotópos tumorok csökkent növekedési rátája könnyen kimutatható volt . A tumor növekedésének tanulmányozására való felhasználásán kívül ez a modell a tumorinvázió mechanizmusának vizsgálatára is alkalmazható. Egy átfogó tanulmány rámutatott a CD44H sejtfelszíni molekulának a tumorinvázióban való részvételére a T.T ESCC sejtekből származó ortotópos tumorok és a T.T-1 ESCC sejtek invazív megfelelője között megfigyelt invazív minták alapján. A T.T-1 ESCC sejtvonal magas szinten expresszálta a CD44H-t, és a nyaki nyirokcsomóból izolált tumorsejtekből származott egy T.T ESCC sejtekből származó ortotópos tumor xenograft modellben . A tumor növekedésének és inváziójának tanulmányozásán túlmenően ez a modell alkalmas a vizsgált vegyületek kezelés utáni túlélésre gyakorolt hatásainak értékelésére is. Az ortotópos ESCC-tumort hordozó állatokban meghosszabbodott túlélést figyeltek meg az mTOR-gátló temsirolimusszal történő kezelés után, amelyre ezt a gátlót jelenleg a vesesejtes karcinóma kezelésére használják .

Az ortotópos tumor xenograft modell általában kiegészíti a szubkután modell rendszeres használatát az ESCC tanulmányozására azáltal, hogy megfelelő tumoros mikrokörnyezetet biztosít. Ezenkívül ez a modell nélkülözhetetlen eszközként funkcionál a preklinikai kutatásban a vizsgált vegyületek/gyógyszerek tumorellenes hatásainak vizsgálatához (3. táblázat).

A betegből származó tumor xenograft modell

A betegből származó tumor xenograft modell a fent említett modelleknél fejlettebb állati rákmodell az ESCC kutatásában. Ezt a modellt a betegekből reszekált ESCC-tumorok felhasználásával hozták létre, hogy immunhiányos állatokban tumor-xenotranszplantátumokat fejlesszenek ki. A beteg tumorokat szubkután vagy ortotópiásan lehet beültetni. A tumor beültetési helyétől függően ez a modell is megtart bizonyos jellemzőket, mint a szubkután és ortotópos tumor xenograft modellek. Figyelemre méltó, hogy a beteg tumorokból származó tumor xenograftok genetikai, szövettani és fenotípusos tulajdonságai megmaradtak a donor tumorokéhoz hasonlóan. Mivel a betegből származó tumor xenograftok stroma- és sejtkomponensei ugyanúgy megmaradnak, mint a donor tumoroké, e modell alkalmazásával kizárhatók a homogén tumorsejtvonalak használatával járó hátrányok. Ezen előnyök ellenére ez a modell elkerülhetetlenül számos korlátozástól szenved. A modell létrehozásához reszekált beteg tumorok használata szükséges, amihez egyes alapkutatási laboratóriumok nem biztos, hogy hozzáférnek ehhez a mintaforráshoz. Emellett a beteg tumorok beültetési aránya a tumor xenograftok kialakításához szuboptimális, és számos tényezőtől, például a tumor típusától, a tumor beültetési helyétől, az egértörzsektől, a tumor jellemzőitől és a beteg jellemzőitől függően változik . Még egy sikeresen beültethető beteg tumor esetében is hosszú látenciaidőre van szükség ahhoz, hogy tumor xenografttá nőjön, és ez a folyamat néha akár 6 hónapig is eltarthat. Ezért a fenti korlátozások a tumor létrehozásának folyamatát magas költségű és munkaigényes eljárássá tették. E hátrányok ellenére ez a modell fokozatosan felváltja az egyéb állati rákmodelleket a közép- és késői stádiumú kutatásokban, és különösen előnyös az új vegyületek/gyógyszerek daganatellenes hatékonyságának preklinikai értékeléséhez. Valóban, ezt a modellt néha “klinikai vizsgálatok egérben” néven emlegetik, mivel a tumor xenograftok és a donor tumorok közötti nagyfokú hasonlóság miatt kiválóan alkalmas a tesztvegyületek/gyógyszerek klinikai válaszának előrejelzésére .

Az összes előny és hátrány figyelembevételével a betegből származó tumor xenograft modell nemcsak az ESCC betegségmechanizmusainak tanulmányozásához nyújthat kutatási platformot, hanem megkönnyítheti a preklinikai gyógyszerszűrést is. Ez utóbbi alkalmazáshoz ezt a modellt előnyösebb használni, mint a szubkután és ortotópos modelleket, mivel nagy a klinikai relevanciája, ami támogatja az új vegyületek/gyógyszerek daganatellenes hatékonyságának értékelését. Ezen a területen az egyes kutatócsoportok saját, betegből származó, megőrzött tumorheterogenitású tumoros xenograft modellek gyűjteményét hozták létre az ESCC-re ható gyógyszerek vagy gyógyszerkombinációk szűrésére (4. táblázat).

Az ESCC-ben gyakran előforduló, jól jellemzett molekuláris deregulációkkal rendelkező, betegből származó tumoros xenograft modellek eszközként használhatók a jelenleg használt gyógyszerek ESCC-re történő új felhasználásának tesztelésére. Ez a folyamat azért fontos, mert új gyógyszereket kutathat a jelenlegi gyógyszeres kezelésekkel szemben rezisztens betegek számára. A ciszplatin és az 5-fluorouracil az ESCC kezelésére használt két kemoterápiás gyógyszer, azonban nem minden beteg reagál jól a gyógyszerekre. A gyógyszermechanizmus jobb megértése érdekében Zhang és munkatársai betegektől származó tumoros xenograft modellekből álló panelt hoztak létre, és jól jellemezték őket az ESCC-ben gyakran észlelt gyakori genetikai aberrációk, például a HER2 expressziója és az EGFR (epidermális növekedési faktor receptor), a K-ras, a B-raf és a PIK3CA (foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát-3-kináz katalitikus alegység alfa) mutációi tekintetében. A ciszplatin és az 5-fluorouracil kezelési hatásának vizsgálatára jól jellemzett HER2 és PIK3CA státuszú xenotranszplantátumokat használva a HER2-negatív és vad típusú PIK3CA-t hordozó tumoros xenotranszplantátumok érzékenyebbek voltak az ilyen kezelésre a HER2-pozitív xenotranszplantátumokkal összehasonlítva, függetlenül a PIK3CA mutációs státuszától. Az e vizsgálatból származó eredmények feltárták a tumor genetikai összetétele és a kemoterápiás gyógyszerekre adott válaszok közötti kapcsolatot.

A betegektől származó, meghatározott genetikai összetételű tumor xenograft modellek hagyományos kemoterápiás gyógyszerek tesztelésére történő felhasználása mellett ezeket a modelleket olyan gyógyszerek tumorellenes hatékonyságának vizsgálatára is használták, amelyeket klinikailag nem alkalmaznak ESCC esetében, mint például a trastuzumab és a lapatinib. A trastuzumab hatásának vizsgálata a betegekből származó tumor xenotranszplantátumokon azt mutatta, hogy a HER2-pozitív ESCC érzékeny volt az ilyen kezelésre, de az egyidejűleg PIK3CA-mutációt hordozók esetében nem. Ezeknek a HER2-pozitív és PIK3CA-mutációval rendelkező tumor xenograftoknak az AZD5363 AKT-gátlóval történő további kezelése ezt követően újra érzékennyé tette a xenograftokat a trastuzumabkezelésre . Egy másik tanulmány a lapatinib érzékenyítő hatását vizsgálta az oxaliplatin vagy az 5-fluorouracil kemoterápiás gyógyszerekre egy betegből származó tumor xenograft modell segítségével. A lapatinib 5-fluorouracillal kombinált kezelése erősebb növekedésgátló hatást eredményezett, mint a lapatinib önmagában vagy az oxaliplatinnal kombinált kezelése . Ezek a vizsgálatok egyértelműen bemutatták e modellek hasznosságát a preklinikai gyógyszerkísérletekhez. Fontos, hogy az ilyen, meghatározott genetikai háttérrel rendelkező tumor xenograftokon végzett vizsgálatok elősegíthetik a precíziós orvoslás fejlesztését azáltal, hogy a gyógyszeres kezelést a tumorok genetikai deregulációi alapján választják ki.

A betegektől származó tumor xenograft modellek a donor tumorok és a létrehozott tumor xenograftok közötti nagyfokú szövettani és patológiai relevancia miatt utánozhatják a klinikai körülmények genetikai sokféleségét és összetételét. Ezek a korábbi tanulmányok bemutatták e modellek preklinikai alkalmazását a különböző gyógyszerek/vegyületek tumorellenes hatékonyságának értékelésére (3. táblázat). A levezetett eredmények szilárd bizonyítékokkal is szolgálhatnak az új gyógyszerek/vegyületek ESCC kezelésére történő felhasználásának alátámasztására. Az ilyen preklinikai vizsgálatok ezért létfontosságú platformot képeznek a klinikai vizsgálatok előtt.