Clostridium botulinum – Botulizmus (klinikai formák). Vizsgálatok a botulizmus diagnózisára. A toxin kimutatása betegekből, élelmiszerekből, takarmányokból, iszapból vagy vízi üledékekből; vízimadarakból, egyéb mintákból. Ajánlott vizsgálatok: toxin kimutatása, C. botulinum kultúra, tipizált botulinum toxin; molekuláris diagnózis (PCR).

A Clostridium botulinum és a botulinum toxin/s jellemzői

A Clostridium botulinum szigorúan anaerob grampozitív bacilus, Clostridium nemzetség, Clostridiaceae család, spóraképző, amely neurotoxikus toxint termel. Ez a baktérium általában talajban és kezeletlen édesvízben és üledékben (óceánok, tavak) található, és világszerte elterjedt. Bizonyos körülmények között ez a szervezet szennyezheti az élelmiszereket, és azokban elszaporodva termelheti a toxinját/toxinjait. A botulizmus, az ételmérgezés súlyos formája, a toxint tartalmazó élelmiszer lenyelése következtében alakul ki. Bár ez a betegség ritka, a halálozási arányuk magas. Amikor az 1899 és 1990 között az Egyesült Államokban észlelt 1036 eset közül meghatározták a toxin típusát, 384 esetben az A toxin, 106 esetben a B toxin, 105 esetben az E toxin és 3 esetben az F toxin volt az oka. Néha előfordulhatnak két toxin, például A és B toxin okozta esetek.

A humán vagy állati botulizmus minden formáját a Clostridium botulinum baktérium szaporodása során képződő botulinum toxin felszívódása okozza. A toxin toxicitása (neurotoxicitása) igen magas, így rendkívül alacsony szinteken fejti ki hatását, hőálló, míg a baktérium spórái hőállóak és túlélnek a 100ºC fölé melegített élelmiszerekben, például hőkezelés alatt konzervekben. Emellett a C. botulinum, a C. butyricum, a C. baratii és a C. argentinense egyes törzsei képesek botulinum neurotoxint termelni.

Hét toxintípus (A – G) különböztethető meg semlegesítési tesztekkel, amelyek hasznosak a klinikai és járványtan számára. Az A, B, E és F típusok az emberi botulizmus fő okozói, míg a C és D típusok az állati botulizmus eseteiben fordulnak elő, a leginkább érintettek a vadon élő madarak és baromfi, szarvasmarha, ló és egyes halfajok. Az A és B típusok a leggyakoribbak az embereknél, és főként az otthon elkészített zöldségkonzervek szennyeződésével hozhatók összefüggésbe, de Európában ezeket a típusokat húskészítményekkel kapcsolatban is találták. Az E-típus (halak) vízi környezetben található, és összefügg a szennyezett halakkal vagy kagylókkal kapcsolatos E botulizmusos esetekkel, és egyre növekszik. Az F típus kivételes. A C típus C1 (idegméreg) és C2 (nem idegméreg, befolyásolja az érrendszeri permeabilitást és enterotoxikus) típusra oszlik. A G típust a C. argentiniense termeli (Argentínában talajból, elhunyt betegek szérumából izolálták, bár nem egyértelmű az érintettség).

A toxinok a baktérium növekedése során szintetizálódnak inaktív fehérje formájában (150 kDa), amely a baktériumból a lízis során szabadul fel. Az aktiváláshoz a képződött toxinnak két polipeptidláncra (50 és 100 kDa) kell lebomlania.

A C. botulinum, tenyésztési tulajdonságaik, biokémiai és fiziológiai jellemzőik alapján csoportokra osztható. Az A típusú tenyészetek mindegyike, valamint a B és F típusúak egy része proteolitikus. A C. botulinum C és D típusú toxinokat termelő tenyészetek nem proteolitikusak, ha koagulált tojásfehérjét vagy húst tartalmazó táptalajban tenyésztik őket. Az E típusok mindegyike, valamint a B és F típusok egy része nem proteolitikus, de a szénhidrát-anyagcsere jellemzői különböznek a C és D típusú nem-proteolitikus csoportoktól. A G típus törzsei nem A hatékony és kielégítő jellemzéshez elegendő részletességgel tanulmányozták.

A növekedés és a toxintermelés optimális hőmérséklete a proteolitikus törzsek esetében körülbelül 35 ºC; a nem-proteolitikus törzsek esetében 26-28 ºC. A nem proteolitikus B, E és F típusú törzsek hűtési hőmérsékleten (3-4ºC) is képesek toxint termelni. A nem proteolitikus törzsek toxinjai csak akkor mutatják maximális toxicitásukat, ha a toxint tripszinnel aktiválják. A proteolitikus törzsek toxinjai általában aktivált formában termelődnek.

A botulizmus klinikai formái

A humán botulizmusnak négy klinikai formája van:

• Élelmiszer-mérgezés (élelmiszer-botulizmus), Clostridium botulinummal szennyezett élelmiszer elfogyasztása következtében, amelyben a toxin képződik.

• Sebbotulizmus, a seb Clostridium botulinummal való fertőzésével és a baktérium sebben való tenyésztése után in vivo toxin kialakulásával keletkezik.

• Szülöttkori botulizmus, a Clostridium botulinummal kolonizált kisgyermekek emésztőrendszerében a toxin termelődésével (a leggyakoribb ok a szennyezett méz vagy kukoricaszirup lenyelése), majd a toxin felszívódásával. Ezek a betegek a toxinnal szemben antitestekkel rendelkezhetnek.

• Felnőttek bélbotulizmusa, amelyet az idősek Clostridium botulinummal való emésztőrendszeri kolonizációja, majd a toxin felszívódása okoz. Ezeknek a betegeknek lehetnek antitestjeik a toxinnal szemben.

A humán botulizmus bármelyik klinikai formájánál, és ugyanígy az állati botulizmusnál is, a toxin a gyomor-bélrendszerből jut a vérbe, amikor az élelmiszerrel előformázva fogyasztják el, vagy amikor az emésztőrendszert kolonizáló baktérium termeli (kisgyermekek vagy felnőttek), vagy kivételes esetekben gyermekek a baktériummal fertőzött sebből. Vannak olyan élelmiszerek, amelyek nagyobb valószínűséggel tartalmaznak botulinumtoxint, mint mások. A 4,5-nél kisebb pH-értékű élelmiszerek nehezebben okoznak botulizmust, mivel ennél a pH-nál a C. botulinum nem képes szaporodni és toxint termelni (ilyenek a gyümölcslevek, ecettel pácolt ételek stb.). Ezzel szemben a 4,5 pH-val egyenlő vagy annál magasabb pH-jú élelmiszerek botulizmust okozhatnak, mivel ezekben a szaporodás és a toxintermelés lehetséges (ez a húsok, halak, zöldségek, készételek stb. esete), mindazokon az élelmiszereken oxigénmentes expozíció, mint a konzerv vagy vákuumcsomagolt élelmiszerek esetében, és amelyek pH-ja 4,6-nál nagyobb. Példák a veszélyes élelmiszerekre: pácolt sonka, füstölt, konzervált hal vagy zöldség (a spórák elpusztításához elégtelen hőkezelésnek alávetve) stb. A C. botulinummal szennyezett konzervek általában görbék, bár ez az E típus esetében nem fordul elő.

A felszívódó toxin visszafordíthatatlanul kötődik a motoros neuronok neuromuszkuláris csomópontjaihoz, megakadályozva az acetilkolin felszabadulását, és petyhüdt bénulást vagy izomgyengeséget okoz.

Klinikailag akut petyhüdt bénulás jellemzi, amely általában a koponyaidegek kétoldali érintettségével kezdődik, az arc, a fej és a garat izmait érinti, majd szimmetrikusan lefelé haladva a mellkasi izmokat és a végtagokat érinti. A halál, ha bekövetkezik, a felső légutakat elzáró nyelv- és garatizmok bénulása, vagy a rekeszizom és a bordaközi izmok bénulása következtében fellépő légzési elégtelenség miatt következik be. Emiatt a betegeknek botulinum-antitoxint kell kapniuk és légzésintenzív ellátásra van szükség.

Diagnosztikai vizsgálatok botulizmusra

A botulinum toxin kimutatása mintákban vagy élelmiszerekben tenyésztés nélkül (lásd az ajánlott mintát az “IVAMI által kínált vizsgálat és a szükséges minták” című vizsgálati részben).

Ez olyan betegnél ajánlott, akinél a botulizmus klinikai jelei mutatkoznak.

A botulinum toxin kimutatása folyadékból, például vérből nyert szérumból is elvégezhető. A botulizmus esetét vagy kitörését okozó, elfogyasztott élelmiszer maradványaiból is kimutatható. A vizsgálat elvégzéséhez az élelmiszer-maradványok felhasználásával egy kivonatos szűrletet kell nyerni belőlük. Csecsemőbotulizmus vagy bélbotulizmus esetén kimutatható a toxin jelenléte a gyermekek vagy betegek székletében, de célszerűbbnek tartják a széklet előzetes tenyésztésének elvégzését (lásd alább ). A botulizmus toxin kimutatása bármelyik esetben a botulinum toxinnal beoltott mikrobákba történő beoltással történik, amelyeknél bénulásos tünetek alakulnak ki, majd halál következik be, ha botulinum toxinnal oltják be őket. Annak megerősítésére, hogy az egerek a beoltott botulinumtoxintól pusztultak el, semlegesítési tesztre van szükség, amely megerősíti, hogy ott botulinumtoxin volt jelen, és azonosítja a jelen lévő botulinumtoxin típusát. Ezt a semlegesítési vizsgálatot a beoltott termékkel (személy vagy állat széruma, lenyelt élelmiszerből származó kivonat, …) az egyes toxintípusok specifikus antiszéráival szemben végzik.

A semlegesítési vizsgálat lépése előtt ki kell számítani a minimális halálos dózist (MLD). Így kiszámítjuk a maximális (legnagyobb) hígítást, amely a fertőzött állatok elpusztulását okozza, és a beoltott térfogat okozta az állatok elpusztulását tartalmaz egy halálos minimális dózist (LMD).

A toxin típusának azonosításához, miután ismert a “Minimális Letális Dózis”, ezt különböző anti-toxin botulinum típusú antisérákkal szembesítjük. Ezeket a keverékeket egyenlő mennyiségben beoltják a kísérleti egerekbe, és azokat, amelyek túlélnek, beoltották a “minimális letális dózis” keverékével plusz egy olyan típusú antiszérummal, amely képes volt semlegesíteni.

A toxin kimutatása a mintákban / termékekben előkultúrázás után (lásd az IVAMI által kínált vizsgálatban ajánlott minta után és a szükséges minták).

Ha a toxint termelő Clostridium botulinum baktérium megtalálható a mintában, ajánlott a toxint előkultúrázás után, a minta előkultúrázása után vizsgálni. Ilyen eset a csecsemőbotulizmusban vagy bélbotulizmusban szenvedő beteg széklete, olyan elfogyasztott élelmiszer maradványa, amelyben elszaporodott a baktérium (pl. gr. konzervdoboz), olyan gyanús élelmiszer, amely tartalmazhatja a baktériumot (pl. gr. puffasztott konzerv), olyan élelmiszer, amelyet e baktérium jelenlétének kizárására ellenőrzött (pl. gr, kolbászok, sonkák, konzervek), vagy egyéb minták, például édesvízi iszapok vagy vízi tengeri üledékek stb. olyan területekről, ahol a vízimadarak elhullását észlelték.

A laboratóriumban, megfelelő táptalajon történő tenyésztés során a toxin termelődik, ha van baktérium, és a tenyésztési szűrlet nyerése hasznos lehet a jelenlétének vizsgálatára, a szűrlet beoltásával egerekbe. Ha beoltott egerek érintettek jelzi a Clostridium botulinum valószínű jelenlétét a mintában o tenyészetben történő növekedés. Az egerek azonban más okból is elpusztulhattak, ezért szükséges, mielőtt a jelentést kiállítják, ellenőrizni kell, hogy valóban azért pusztultak-e el, mert botulinum toxinnal oltották be őket.

A botulinum toxin kultúrában való jelenlétének megerősítésére a botulinum toxin egyes típusaira specifikus antiszérákkal végzett semlegesítési tesztek (semlegesítési teszt) végezhetők, vagy a Clostridium botulinum génjeinek és típusának kimutatása a táptalajban (molekuláris kimutatás PCR-rel).

A semlegesítési vizsgálatot a beoltott mintával (tenyésztési szűrlettel) az egyes toxintípusokra specifikus antisérákkal szemben végzik.

A semlegesítési vizsgálati lépés előtt ki kell számítani a minimális halálos dózist (MLD). Így kiszámítják azt a (legnagyobb) maximális hígítást, amely a beoltott állatok elpusztulását okozza, és az a beoltott mennyiség, amely az állatok elpusztulását okozta, tartalmaz egy minimális letális dózist.

A toxin típusának azonosítása érdekében, miután ismert a “minimális letális dózis”, a minimális letális dózis szembeállítását különböző típusú anti-botulinum szérumokkal végzik. Ezeket a keverékeket azonos térfogatban beoltják a kísérleti egerekbe, és azokat, amelyek túlélték, beoltották a “minimális halálos dózis” keverékével plusz a semlegesíteni képes típus antiszérumával.

A molekuláris kimutatás PCR segítségével elkerüli a minimális halálos dózis (MLD) kiszámításához és a semlegesítési teszthez szükséges időt.

A botulinum toxin elleni antitestek kimutatása (lásd az ajánlott minta után az IVAMI által kínált vizsgálat és a szükséges minták című részben)

• A hígított botulinum toxinnal kezelt betegek, például azok, akik esztétikai vagy orvosi kezelés céljából botoxot kapnak (pl. gr. az arc trigeminalis neuralgiája okozta fájdalom), a hatást gátló antitestek jelenlétének kimutatására.

• Csecsemőbotulizmus vagy felnőtt botulizmus gyanújával kezelt betegek, akiknél a Clostridium botulinum toxin baktériumot nem sikerült kimutatni a székletben vagy a szérumban.

• Oltott személyek, akiket érdekel a védettség állapotának ellenőrzése.

A Clostridium botulinum toxin nagyon nagy hígításban, helyi alkalmazással spasztikus folyamatok kezelésére használták. Ezek a folyamatok hasznos gyógymódnak bizonyultak. Ezek a folyamatok általában krónikus spasztikusak, így a toxint tartósan kell alkalmazni. Ezért a kezelés során rezisztencia alakulhat ki a beteg fokozatos immunizálódása miatt a kezelés során, amely esetben a hatás korlátozott lenne. Ennek az immunizációnak a kimutatásához pontosan és érzékenyen kell mérni a botulinum toxin A és/vagy B elleni antitestek meglétét.

A botulinum toxin elleni antitestek kimutatására és mennyiségi meghatározására elfogadott referencia-módszer az egereken végzett neutralizációs teszt (Mouse Neutralization Assay), amelyben a botulinum toxin 50%-os halálos dózissal (DL50) számszerűsített hígítását egérre vonatkozóan a szérum/plazma különböző 2-es vagy 4-es bázisú hígításaival keverik, és inkubáció után mindegyiket intraperitoneálisan beoltják egércsoportokba. A vizsgált szérum legnagyobb hígítása, amely csökkenti a toxicitást, megfelel a megfelelő botulinum toxin elleni antitest-titernek. Ez a hígítás egy nemzetközi standardhoz viszonyítva lehetővé teszi az eredmények nemzetközi egységekben (IU/mL) történő meghatározását (1 IU az az antitestmennyiség, amely 10 000 LD50 A vagy B típusú toxint vagy 1000 LD50 E típusú toxint semlegesít). A tesztekben használt toxin mennyisége olyan, amelyet 0,02; 0,005 és 0,0125 IU/mL antitoxin semlegesít az A, B és E típusok esetében (Hatheway és mtsai. 1984). Az 1:4-es egértiterrel védett szérumokat az A típus esetében <0,08 NE/ml, a B típus esetében <0,02 NE/ml. A teszt elvégzése munkaigényes, költséges és hosszú ideig tart, ezért alternatívákat kerestek enmzimoinmunoanálisis alapú módszerekkel (ELISA), botulinum toxinnal bevont mikrolemezeket használva. Az ELISA-val kapott értékek azonban néha nem teljesen korrelálnak az egereken végzett neutralizációs teszttel.

A neutralizációs teszt lépése előtt ki kell számítani a toxin minimális halálos dózisát (DLM). A minimális letális dózis kiszámítása a tenyésztési szűrlet 10-es bázisú hígításával történik, a felét fiziológiás sóoldattal hígítják, hogy a beteg szérumával vagy plazmájával kevert toxinnal azonos hígítást kapjanak, és minden egyes hígítási keveréket laboratóriumi egerekbe oltanak. Így számítják ki azt a (legnagyobb) maximális hígítást, amely a fertőzött állatok elpusztulását okozza. A beoltott mennyiség, amely az állatok elpusztulását okozta, tartalmaz egy minimális halálos dózist (MLD).

A minimális halálos dózis ismeretében számítsa ki a minimális nem halálos dózist (dmnm), amely megfelel a toxin minimális mennyiségének, amely állandó mennyiségű antitoxin jelenlétében nem öli meg a beoltott egereket. Ezt a toxinmennyiséget a megfelelő egységnyi anti-A antiotoxin vagy anti-B antitoxin semlegesíti. Minimális nem halálos dózisnak nevezik, mert ez az a minimális toxinmennyiség, amely antitoxin jelenlétében nem okozza az egerek halálát.

Az IVAMI által kínált vizsgálatok és a szükséges minták:

• Botulinum toxin kimutatása emberi esetekben vagy élelmiszer eredetű botulizmus kitörésekben:

• • Egerek beoltásához és toxin tipizálásához legutóbb nyert betegszérum (legalább 5 ml), ha az egerek érintettek voltak.

• • Csecsemőbotulizmus vagy bélbotulizmus esetén a botulinum toxin kimutatható a gyermekek/betegek székletében, de célszerűbb előzetes széklettenyésztést végezni.

• A toxin és/vagy a Clostridium botulinum kimutatása a lenyelt, botulizmusra gyanús, vagy ellenőrzés alá vont élelmiszerekben

• • A gyanús vagy ellenőrzött élelmiszerből vett minta (legalább kb. 100 gramm ajánlott) az egerek beoltására és az előképzett toxin élelmiszerben való kimutatására szánt minta elkészítéséhez, valamint tenyésztés elvégzésére az egerek beoltásához és annak megállapításához szükséges szűrlet kinyeréséhez, hogy a mintában volt-e toxintermelő baktérium; Ha csak élelmiszer-maradékkal rendelkezik, ajánlott a rendelkezésre álló teljes mennyiséget elküldeni.

• A Clostridium botulinum kimutatása csecsemőbotulizmus vagy bélbotulizmus esetén

• Bélsár csecsemőbotulizmus vagy bélbotulizmus esetén bélkolonizáció miatt (10 g), tenyésztéshez és toxin kimutatásához a tenyésztési szűrletben egerek beoltásával.

• Clostridium botulinum kimutatása sebbotulizmus esetén

• • Sebváladék sebbotulizmus gyanúja esetén, tenyésztéshez és toxin kimutatásához a tenyésztési szűrletben egerek beoltásával. Ha a mintát aerob módon szállítják, a Clostridium botulinum inaktiválódhatott, célszerűbb lenne molekuláris tesztet végezni a Clostridium botulinum gének jelenlétére, és pozitív eredmény esetén azonosítani a botulinum toxin típusát az egyes toxintípusoknak megfelelő gének kimutatásával.

• A Clostridium botulinum kimutatása édesvízi iszapból vagy vízi tengeri üledékből származó mintákban és más, az előző szakaszokban nem szereplő termékekben

• • Kb. 100 g minta a Clostridium botulinum tenyésztésének elvégzésére és az egerek beoltásához szükséges tenyésztési szűrlet kinyerésére.

• Botulinum toxin elleni antitestek kimutatása szérumban vagy plazmában

• • Szérum vagy plazma (kb. 10 ml), a laboratóriumban rendelkezésre álló különböző toxinokkal szembeni semlegesítő antitestek szérumban vagy plazmában történő vizsgálatához. Ez a vizsgálat a specifikus antitestek jelenlétének meghatározására szolgál botulinumtoxinnal kezelt személyeknél, csecsemőbotulizmus gyanújában szenvedő betegeknél, olyan felnőtteknél, akiknél a baktériumot nem sikerült kimutatni a székletben, vagy oltott személyeknél a védettség állapotának ellenőrzésére. Botulinum toxinnal kezelt személyek esetében Meg kell jelölni a betegnek beadott toxin típusát.

Az eredmények jelentésének ideje (TAT)

• Pontos időt nem tudunk megadni. Ha csak a toxin egérinjekcióval történő kimutatására irányuló vizsgálatot végeznek, és az eredmény negatív, az eredményjelentés legfeljebb egy hétig tarthat. Ha a vizsgálat magában foglalja a minta tenyésztését, majd az egerek tenyésztési szűrletének beoltásával előállított toxin kimutatását, az idő két hét lenne. Ha e tesztek bármelyike egér beoltása, a mintából vagy tenyésztési szűrletből származó kivonat pozitív, semlegesítési tesztet kell végezni egereken annak megerősítésére, hogy botulinum toxinról van szó, és semlegesítési tesztekkel azonosítani a típusát, a teljesítési idő 15 nap.

• A valós idejű PCR-tesztek a jelentés 3 vagy 4 nap.

Formanyomtatvány a termék jellemzőivel és a kiválasztott vizsgálat(ok)kal

• A termékkel történő vizsgálatok elvégzésére irányuló kérelem esetén be kell nyújtani egy levelet, amelyben a termék jellemzői és a kiválasztott, a beküldött mintával elvégzendő vizsgálatok szerepelnek.

Minta mennyisége

• Minden esetben az IVAMI által kínált vizsgálatok típusától függően.

Tárolási feltételek és a minták szállítása

• A minták küldése azokon a feltételeken történik, amelyek között a minta általában megtalálható, szállításra védve. Az olyan minták esetében, amelyek bomolhatnak, mert baktériumokkal vagy saját szerves anyagukkal szennyezettek (romlandó anyagok, állati vagy emberi szérumok, ürülék, iszap, … …), a mintákat fagyasztva kell tárolni és szállítani, vagy legalábbis olyan körülmények között, amelyek biztosítják a hűtést a szállítás során (a mintatartályt egy dobozban -bővített polisztirol- (fehér parafa), hűtőcsomaggal fagyasztva. Megjegyzés: ez az organizmus önmagában nem jelent fertőzési kockázatot biológiai expozícióval.

Vizsgálati költség

• Toxin kimutatása emberi esetekben/élelmiszer eredetű botulizmus kitörésekben

• • Egerek beoltása a beteg szérumával vagy lenyelt élelmiszer kivonatával ….. ………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………Konzultáció [email protected]

• Ha pozitív, megerősítő vizsgálat a semlegesítésre és a toxin típusának azonosítására …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Konzultáció [email protected] .

• A toxin és/vagy a Clostridium botulinum kimutatása a lenyelt, botulizmus gyanúját keltő vagy ellenőrzés alá vont élelmiszerekben

A Clostridium botulinum kimutatása csecsemőbotulizmus vagy bélbotulizmus esetén

• Választható: ………………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………Konzultáljon a [email protected]

oldalon.

• Egerek beoltási tesztje szérummal vagy lenyelt élelmiszer kivonatával ………………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………Consult [email protected]

• Javasolt. Kultúrateszt, majd egerek beoltása tenyésztési szűrlettel ………………………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consult [email protected]

• Ha pozitív, megerősítő vizsgálat a semlegesítésre és a toxin típusának azonosítására …………………….. …………………………………………………………………………………………………………..Konzultáció [email protected]

• A Clostridium botulinum kimutatása sebbotulizmus esetén

• Kultúrateszt, majd egerek beoltása a kultúrafiltrátummal …………………….. Konzultáció [email protected]

• Pozitív eredmény esetén megerősítő vizsgálat a semlegesítésre és a toxin típusának azonosítására …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Konzultáció [email protected]

• A Clostridium botulinum kimutatása iszap/édesvíz vagy tengeri üledék mintákban és más, az előző szakaszokban nem szereplő termékekben

• • Kultúrateszt, majd egerek beoltása tenyésztési szűrlettel …………………….. Konzultáció [email protected]
  • Ha pozitív, megerősítő vizsgálat a semlegesítésre és a toxin típusának azonosítására ………………. …………………………………………………………………………………………………………..Konzultáció [email protected]

• Anti-botulinum toxin kimutatása a szérumban vagy plazmában (az ellenanyag típusára utal, ezért meg kell jelölni az egyénnek beadott toxin típusát) ………………………………………………… Consult [email protected]