3.1 Enzimi endogeni del pesce
Come discusso sopra, vari enzimi proteolitici si trovano nei visceri, nel tratto digestivo e nel tessuto muscolare dei pesci.
Le principali proteinasi endogene nelle acciughe sono la tripsina, la pepsina, la chimotripsina, l’elastasi e l’aminopeptidasi (Martinez & Serra, 1989; Siringan, Raksakulthai, & Yongsawatdigul, 2006). Gli enzimi digestivi di tripsina, chimotripsina e pepsina sono considerati i tre enzimi più importanti rispetto agli altri (de la Parra, Rosas, Lazo, & Viana, 2007). La pepsina si trova solitamente nello stomaco dei pesci ed è un enzima principale dei succhi digestivi (de la Parra et al., 2007). La tripsina è presente nei visceri, nella caeca pilorica e nella milza (Kishimura, Hayashi, Miyashita, & Nonami, 2005, 2006; Kishimura et al., 2007; Klomklao et al., 2006). L’epatopancreas degli organi digestivi di pesci e crostacei contiene sia attività peptidasi che proteinasi come aminopeptidasi, proteasi gelatinolitiche, tripsina e chimotripsina, e proteasi collagenolitiche (Sriket, 2014).
Si è scoperto che la maggior parte delle attività di lipolisi e proteolisi nella lavorazione del peda sono state registrate nell’intestino, soprattutto all’inizio del processo di fermentazione; tuttavia, le attività diminuiscono rapidamente durante il processo (Irianto, 1990). Considerando che gli enzimi si trovano nei visceri e nel tratto digestivo, l’eviscerazione gioca un ruolo importante nel determinare il tasso e il tipo di degradazione enzimatica che si verifica. I prodotti ittici fermentati lavorati utilizzando il pesce intero avranno caratteristiche diverse da quelli prodotti da pesci decapitati ed eviscerati (Wheaton & Lawson, 1985). L’attività enzimatica della maggior parte degli enzimi del tratto viscerale e digerente del pesce aveva la massima attività a valori di pH quasi neutri (Bougatef et al., 2007; Munilla-Moran & Saborido-Rey, 1996).
Castillo-Yañez, Pacheco-Aguilar, Garcia-Carreño, e Toro (2004) hanno isolato un enzima proteolitico acido, che appartiene alla classe delle proteasi aspartiche dai visceri delle sardine. L’enzima è simile alla pepsina II di altre specie di pesci ed è stabile a pH 3-6 e 45°C.
Le caverne piloriche rappresentano gli organi che sono la fonte principale di proteinasi alcaline. Un enzima simile alla tripsina ottenuto dalla caeca pilorica del merluzzo (G. morhua) aveva un punto isoelettrico di 5,30 e 5,89 ed era molto simile nella composizione aminoacidica alla tripsina bovina, ma differiva per avere una maggiore quantità relativa di aminoacidi acidi e una minore quantità di aminoacidi basici. L’enzima ha anche idrolizzato substrati di proteine di pesce (Beirão, Mackie, Teixeira, & Damian, 2001).
Tre proteinasi alcaline e due proteinasi acide sono state isolate dalla sardina. Ciascuna delle proteinasi alcaline ha idrolizzato la caseina più rapidamente di altre proteine. Una delle principali proteinasi alcaline (III) ha idrolizzato le proteine sarcoplasmatiche della sardina cinque volte più velocemente delle altre proteinasi alcaline. Ciascuna delle due proteinasi acide ha idrolizzato l’emoglobina e la mioglobina più rapidamente delle altre proteine. Dopo la preincubazione con 25% NaCl, una proteinasi alcalina (III) e una proteinasi acida (II) erano stabili, mentre le altre proteinasi diventavano instabili. Le due proteinasi, la proteinasi alcalina III e la proteinasi acida II, erano anche stabili per 3 mesi dopo l’inizio della produzione di salsa di pesce. L’attività proteolitica di ciascuna proteinasi alcalina e acida è stata fortemente inibita da più del 15% di NaCl; tuttavia, l’inibizione minima è stata osservata quando le proteine del muscolo di sardina sono state usate come substrato (Noda, Van, Kusakabe, & Murakami, 1982).
Due aminopeptidasi (I e II) sono state estratte da organi interni sgrassati di sardina e purificate mediante cromatografia DEAE-cellulosa, filtrazione su gel su Sephadex G-200 e focalizzazione isoelettrica. Le preparazioni finali degli enzimi I e II sono state giudicate quasi omogenee mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide. I pesi molecolari degli enzimi I e II sono stati determinati dalla filtrazione del gel a 370.000 e 320.000, rispettivamente. I punti isoelettrici erano 4,1 (I) e 4,8 (II), rispettivamente. Entrambi gli enzimi sono stati inibiti da EDTA e attivati da Co++. La bestatina poteva inibire l’enzima I ma non l’enzima II. Gli enzimi I e II hanno idrolizzato rapidamente non solo substrati sintetici contenenti alanina o leucina ma anche di-, tri- e tetra-alanina. Sulla base di tutte queste caratteristiche, le aminopeptidasi di sardina assomigliano all’alanina aminopeptidasi umana. L’enzima I ha mantenuto più del 70% della sua attività originale in 15% NaCl, suggerendo che l’enzima partecipa all’idrolisi delle proteine e dei peptidi del pesce durante la produzione di salsa di pesce (Vo Van, Kusakabe, & Murakami, 1983).
Le attività delle proteinasi alcaline e acide sono state confrontate con la tripsina bovina e la pepsina e hanno mostrato che, come la tripsina bovina, la proteinasi alcalina della caeca pilorica delle sardine ha idrolizzato la caseina più efficacemente di altri substrati proteici (Noda et al., 1982).
Gli enzimi del tessuto muscolare, in particolare le catepsine, le peptidasi, le transaminasi, le amidasi, le decarbossilasi aminoacidiche, le deidrogenasi glutammiche e gli enzimi correlati, si trovano tutti nel tessuto muscolare del pesce (Chaveesuk, 1991), e questi enzimi, in particolare tripsina, chimotripsina e catepsina, sono coinvolti nell’idrolisi delle proteine durante la fermentazione della salsa di pesce (Fernandes, 2016). Gli enzimi del tessuto muscolare si trovano per lo più nelle cellule. D’altra parte, gli enzimi digestivi sono una secrezione esocellulare. Anche se alcuni studi hanno dimostrato che gli enzimi del tessuto muscolare hanno un’attività ottimale a pH neutro, la maggior parte dei rapporti informa che valori bassi di pH accelerano le attività degli enzimi del tessuto muscolare. La maggior parte dei prodotti ittici fermentati sono lavorati a pH superiore a 4, ad eccezione dell’insilato di pesce e di alcuni prodotti ittici fermentati. Di conseguenza, la maggior parte degli enzimi del tessuto muscolare non sono in realtà a condizioni di pH ottimali (Mackie et al., 1971).
La caratterizzazione parziale delle catepsine B del muscolo del sugarello ha indicato caratteristiche simili ad altre catepsine BS. Il pH ottimale della catepsina era 5 con una temperatura ottimale di 50°C. L’attività è stata inibita da E-64, CA-074 e chimostatina (Yoshida et al., 2015).
Le attività enzimatiche massime possono essere ottenute utilizzando pesci interi, comprese le teste e le viscere. Al contrario, l’attività enzimatica minima si verifica quando il pesce decapitato ed eviscerato viene utilizzato per produrre prodotti ittici fermentati. Nel frattempo, attività enzimatiche intermedie possono essere ottenute rimuovendo le interiora in qualsiasi momento dopo la cattura del pesce per permettere una certa diffusione degli enzimi viscerali nei tessuti (Owens & Mendoza, 1985).
Nel pesce salato, la maturazione è descritta da tre ipotesi. Queste sono (1) la teoria microbiologica, (2) la teoria autolitica e (3) la teoria degli enzimi. Nella teoria microbiologica, i microrganismi producono gli enzimi attivi essenziali, e questi enzimi penetrano nella carne e contribuiscono al processo di maturazione. La teoria autolitica descrive che la maturazione è il risultato dell’attività degli enzimi dei muscoli o di altri tessuti, o del tratto gastrointestinale. Infine, la teoria enzimatica spiega che la maturazione del pesce salato avviene sotto l’influenza di alcuni enzimi, cioè quelli contenuti nel tessuto muscolare, quelli negli organi intestinali del pesce, insieme a quelli prodotti dai microrganismi (Mackie et al., 1971).
Nella maturazione delle acciughe, la massima attività autolitica dell’acciuga indiana (Stolephorus indicus) è stata trovata a 60°C. L’attività autolitica è diminuita con l’aumento della concentrazione di NaCl. L’estratto grezzo ha mostrato un pH ottimale a 8,5-9,5. Le proteinasi simili alla tripsina erano le proteinasi predominanti nell’estratto grezzo. Le proteinasi dell’acciuga indiana potrebbero partecipare all’idrolisi delle proteine durante la fermentazione della salsa di pesce. Pertanto, l’incubazione dell’acciuga indiana a 60°C e nel 10% di NaCl per un periodo di tempo prima della salatura completa al 25% di NaCl potrebbe essere un modo efficace per accelerare il processo di fermentazione della salsa di pesce (Siringan et al., 2006).