Classe pratica

Misurare il tempo impiegato dall’amilasi per scomporre completamente l’amido, prelevando campioni a intervalli di 10 secondi e notando il momento in cui la soluzione non dà più un colore blu-nero con la soluzione di iodio (ma la soluzione di iodio rimane arancione). Usare tamponi per fornire soluzioni a diversi pH. Calcolate la velocità di questa reazione controllata dall’enzima calcolando 1÷ tempo.

Organizzazione della lezione

Questa procedura è abbastanza semplice da essere eseguita da singoli individui se avete abbastanza piastrelle con fossette. Se si sceglie di indagare su cinque pH, allora gruppi di cinque studenti potrebbero completare l’indagine lavorando insieme e mettendo in comune i risultati.

Apparato e sostanze chimiche

Salute & Note tecniche e di sicurezza

La soluzione di emilasi e la soluzione di iodio sono a basso rischio una volta preparate. Indossare una protezione per gli occhi quando si maneggia la soluzione di iodio.
I pericoli dei tamponi possono variare. Vedere la scheda ricette CLEAPSS o le informazioni del fornitore e vedere la nota 3.

1 Amilasi (Vedere CLEAPSS Hazcard e scheda ricette) L’enzima in polvere è PERICOLOSO, ma le soluzioni inferiori all’1% sono a basso rischio. È saggio testare, con largo anticipo, l’attività dell’enzima conservato alla sua abituale concentrazione di lavoro per verificare che i substrati siano demoliti ad un ritmo adeguato. Gli enzimi possono degradarsi durante la conservazione e questo permette di avere il tempo di regolare le concentrazioni o di ottenere scorte fresche. L’amilasi perde lentamente attività, quindi è meglio preparare un lotto fresco per ogni lezione; i lotti possono variare in attività e i risultati raccolti in giorni diversi non saranno comparabili. La temperatura ottimale per il vostro enzima sarà indicata sull’etichetta del fornitore.

Utilizzare la saliva: il Manuale di Laboratorio CLEAPSS fornisce indicazioni sulle precauzioni da prendere (comprese quelle igieniche) per utilizzare la saliva in modo sicuro come fonte di amilasi. Questo ha il vantaggio di essere più economico, non richiedendo ai tecnici di preparare soluzioni nuove ad ogni lezione, è direttamente interessante per gli studenti, e l’amilasi salivare è affidabile. Fornisce anche l’opportunità di insegnare buone precauzioni igieniche – tra cui garantire che gli studenti usino solo i propri campioni di saliva (fornire piccoli becher in cui sputare); che gli studenti siano responsabili del risciacquo della propria attrezzatura; e che tutta la vetreria contaminata sia posta in una ciotola o in un secchio di clorato di sodio (I) prima che i tecnici si lavino.

2 Sospensione di amido – fare fresco. Fare una crema di 5 g di amido solubile in acqua fredda. Versare in 500 cm3 di acqua bollente e mescolare bene. Far bollire fino ad ottenere una soluzione chiara. Non usare amido modificato.

3 Tamponi: (Vedi scheda ricette CLEAPSS) Se si prepara un tampone universale, esso conterrà idrossido di sodio a circa 0,25 M e deve essere etichettato come IRRITANTE. Fare riferimento ad altre schede di rischio pertinenti se si sceglie di fare altri tamponi, o alle informazioni del fornitore se si acquistano soluzioni tampone/pasticche. (Nota 1)

4 Soluzione di iodio (Vedi CLEAPSS Hazcard e scheda ricette). Una soluzione 0,01 M è adatta per il test dell’amido. Realizzarla con una diluizione di 10 volte della soluzione 0,1 M. Una volta preparata, la soluzione è a basso rischio ma può macchiare la pelle o i vestiti se versata.

Problemi etici

Non ci sono problemi etici associati a questa procedura.

Procedura

Sicurezza: Tutte le soluzioni una volta preparate sono a basso rischio. Indossare una protezione per gli occhi, poiché lo iodio può irritare gli occhi.

Preparazione

a Controllare la velocità della reazione con i volumi suggeriti di reagenti da usare – 2 cm3 di amido: 2 cm3 di amilasi: 1 cm3 di tampone a pH 6. Idealmente la reazione dovrebbe durare circa 60 secondi a questo pH: questo è l’optimum usuale per l’amilasi (vedi nota 1). Se la reazione è troppo veloce, ridurre il volume dell’enzima o aumentare il volume dell’amido. Se la reazione è troppo lenta, aumentare il volume o la concentrazione dell’enzima o ridurre il volume o la concentrazione dell’amido.

Investigazione

b Mettere singole gocce di soluzione di iodio in file sulla piastrella.

c Etichetta una provetta con il pH da testare.

d Usa la siringa per mettere 2 cm3 di amilasi nella provetta.

e Aggiungi 1 cm3 di soluzione tampone alla provetta usando una siringa.

f Usa un’altra siringa per aggiungere 2 cm3 di amido alla soluzione di amilasi/ tampone, avvia il cronometro e lascialo acceso per tutto il test. Mescolare usando una pipetta di plastica.

g Dopo 10 secondi, usare la pipetta di plastica per mettere una goccia della miscela sulla prima goccia di iodio. La soluzione di iodio dovrebbe diventare blu-nera. Se la soluzione di iodio rimane arancione, la reazione sta andando troppo veloce e l’amido è già stato rotto. Spruzzare il resto della soluzione nella pipetta di nuovo nella provetta.

h Aspetta altri 10 secondi. Poi rimuovi una seconda goccia della miscela da aggiungere alla prossima goccia di iodio.

i Ripeti il passo h fino a quando la soluzione di iodio e la miscela amilasi/ tampone/ amido rimangono arancioni.

j Potresti preparare una goccia di controllo da confrontare con le gocce del test. Cosa dovrebbe contenere?

k Conta quante gocce di iodio hai usato, ognuna delle quali equivale a 10 secondi di tempo di reazione.

l Ripeti l’intera procedura con un altro dei tamponi di pH da usare, o metti insieme i risultati della classe.

m Considera la possibilità di raccogliere dati ripetuti se c’è tempo.

n Tracciare un grafico del tempo impiegato per scomporre l’amido rispetto al pH, o calcolare la velocità di reazione e tracciare la velocità rispetto al pH.

Appunti per l’insegnamento

Questa è una pratica semplice che dà risultati affidabili e non ambigui. I principali errori saranno nell’ordine di miscelazione dell’enzima/substrato/tampone, o un ritardo nel campionamento in modo che il tempo di reazione sia sottostimato o il tasso sia sovrastimato. La variazione di temperatura influenza l’attività dell’enzima, quindi i risultati raccolti in giorni diversi non sono comparabili.

Salute e sicurezza controllate, settembre 2008

Scaricamenti

Scarica il foglio dello studente Indagare l’effetto del pH sull’attività dell’amilasi (72 KB) con domande e risposte.

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