Le gravidanze cronometrate nei topi possono essere impostate in due modi: 1) usare la citologia vaginale per determinare la fase del ciclo estrale di un topo e il momento appropriato per l’accoppiamento; e/o 2) controllare le femmine per i tappi vaginali per determinare se l’accoppiamento è avvenuto.

Valutazione della citologia vaginale

Per ottenere un campione vaginale per determinare la fase del ciclo estrale, inserire un tampone inumidito con punta di cotone nell’apertura vaginale di un topo legato manualmente. La maggior parte dei tamponi disponibili in commercio sono troppo grandi per entrare facilmente nell’apertura vaginale di un topo di medie dimensioni, ma un tampone di dimensioni adeguate può essere fatto avvolgendo una piccola quantità di cotone idrofilo sterile intorno all’estremità smussata di uno stuzzicadenti. Ruotare il tampone delicatamente ma fermamente all’interno della vagina del topo, facendo attenzione a mantenere il contatto con la parete vaginale. Dopo aver rimosso il tampone, pulirlo su un vetrino da microscopio pulito per trasferire il campione vaginale al vetrino. Lasciare asciugare il vetrino all’aria, poi applicare una soluzione acquosa allo 0,1% di blu di metilene per colorare il materiale vaginale. Dopo che la macchia si asciuga, esaminare il campione al microscopio. Lo stadio dell’estro può essere determinato dai tipi e dal numero relativo di cellule presenti:

• Se il topo è in diestro, si vedranno soprattutto leucociti polimorfonucleati (PMN) e alcune cellule epiteliali.
• Se il topo è in proestro, vedrete soprattutto cellule epiteliali nucleate e cornificate. Si vedranno alcune PMN se il topo è all’inizio del proestro.
• Se il topo è in estro, si vedranno soprattutto cellule epiteliali cornificate. Si possono vedere alcune cellule nucleate se il topo è in estro precoce.
• Se il topo è in metesto, vedrete per lo più cellule epiteliali cornificate e PMNs e alcune cellule epiteliali nucleate.

Abbinamento e ovulazione avvengono tipicamente (ma non invariabilmente) durante l’estro, che generalmente si verifica circa sei ore dopo l’inizio del periodo buio e dura 12-14 ore. Per l’accoppiamento a tempo, mettete la femmina con un maschio durante la fase di proestro. Per verificare che l’accoppiamento sia avvenuto, controlla la femmina per un tappo vaginale la mattina successiva (vedi sotto).

Controllo dei tappi vaginali

Anche se la valutazione della citologia vaginale è comunemente usata per determinare il momento migliore per la riproduzione in alcune specie domestiche (come i cani), non è così pratica per i topi perché hanno un ciclo estrale molto breve (4-5 giorni in totale). Un approccio più pratico per i topi è quello di mettere semplicemente il maschio e la femmina insieme, poi controllare la femmina la mattina seguente per un tappo vaginale. Il tappo è fatto di secrezioni coagulate dalle ghiandole coagulanti e vescicolari del maschio. In genere riempie la vagina della femmina e persiste per 8-24 ore dopo la riproduzione. Per vedere il tappo, sollevare la femmina per la base della coda ed esaminare la sua apertura vaginale per una massa biancastra. Può essere difficile da vedere, specialmente se siete meno esperti in questa procedura. Potete vederla meglio se allargate leggermente le labbra della vulva con un tampone di cotone o con l’estremità smussata di uno stuzzicadenti piatto. Se non c’è spina, lasciate la femmina con il maschio e controllatela ogni mattina fino a quando non vedete una spina.

Se avete bisogno di un gran numero di femmine gravide temporizzate, potete sfruttare l’influenza dei feromoni e dei fattori sociali sul ciclo estrale. Alloggiate le femmine in grandi gruppi senza maschi nelle vicinanze. Così facendo, il diestro viene prolungato e l’estro soppresso, un fenomeno noto come effetto Whitten. Poiché i feromoni dei topi maschi possono interferire con questo effetto, la stimolazione olfattiva delle femmine alloggiate in gruppo da parte dei topi maschi deve essere impedita. Quando le femmine vengono messe con i maschi (in genere 1-3 femmine per maschio), il ciclo estrale della maggior parte delle femmine ricomincia entro tre giorni. Per identificare quelle che si sono accoppiate, esaminatele quotidianamente per un tappo vaginale.

La presenza di un tappo vaginale non garantisce la gravidanza: indica solo che l’attività sessuale è avvenuta. La probabilità di gravidanza dopo l’accoppiamento varia con il ceppo del topo e con la fase del ciclo estrale quando avviene l’accoppiamento. Per la maggior parte dei ceppi, il tasso di gravidanza è più alto tra le femmine in estro soppresso con tappi vaginali trovati il terzo giorno dopo essere state messe con un maschio. Per esempio, mentre il tasso di gravidanza è ~100% e 44% rispettivamente per le femmine C3H/HeJ e BALB/cJ con tappi trovati il terzo giorno, è solo 62% e 31% rispettivamente per quelle con tappi trovati il quinto giorno. Al contrario, mentre il tasso di gravidanza per le femmine C57BL/6J è solo del 39% per quelle con tappi trovati il terzo giorno, è del 69% per quelle con tappi trovati il quarto giorno.

Se la femmina con tappo è incinta, il primo giorno di gestazione è considerato il giorno dopo il ritrovamento del tappo.