Il dottor Bang era molto interessato ai sistemi circolatori degli invertebrati. Credeva che studiare gli animali in cui la circolazione poteva essere osservata avrebbe portato ad una maggiore comprensione dei processi fisiologici nei vertebrati, come gli esseri umani.
Nei primi anni ’50, mentre era al Marine Biological Laboratory di Wood’s Hole, nel Maine, Bang studiò il sistema circolatorio del granchio a ferro di cavallo e la sua risposta all’infezione batterica.
Iniezione di batteri ottenuti da acqua marina fresca in granchi a ferro di cavallo di varie dimensioni e studio della loro reazione. Di solito, il sangue formava un piccolo coagulo per sigillare l’area infetta e impedire l’ingresso di altri batteri.
Ma un giorno, Bang notò che uno dei suoi granchi morì per un’infezione sconosciuta che aveva causato il coagulo di quasi tutto il volume di sangue del granchio in una massa semi-solida.
Questo non era mai stato visto prima!
Così isolò e coltivò il batterio del primo animale e lo iniettò in altri granchi a ferro di cavallo. Anche loro sperimentarono la stessa coagulazione e morirono.
Indagando ulteriormente, scoprì che solo i batteri “Gram-negativi” producevano questa reazione.
Note: In 1884, Hans Christian Gram invented a staining procedure for microscopy which came to be called The Gram stain. It stains the bacteria either red (Gram-negative) or violet (Gram-positive) depending on the chemicals they have in their cell walls.
I batteri Gram-negativi causano infezioni come la polmonite e la meningite. Quando Bang ha ucciso a caldo i batteri prima dell’iniezione, ha ancora ottenuto la stessa reazione di coagulazione. Questo significava che i batteri vivi non erano necessari per far coagulare il sangue del granchio a ferro di cavallo.
Pubblicò le sue scoperte nel 1956 e mise da parte le sue osservazioni iniziali per quasi 10 anni.
Entra Jack Levin.
Nel 1963, mentre Bang stava discutendo i dati del suo progetto sul granchio a ferro di cavallo, un collega suggerì che la collaborazione con un ematologo avrebbe potuto aiutare a svelare il mistero della coagulazione. Il collega raccomandò un ricercatore del suo laboratorio, il dottor Jack Levin.
Levin stava usando i conigli per studiare la reazione di Shwartzman – la reazione alle endotossine che causa la formazione di un coagulo all’interno di un vaso sanguigno e altera anche la funzione delle piastrine dei vertebrati.
L’endotossina è un componente chiave della parete cellulare di tutti i batteri Gram-negativi; può essere difficile da individuare ed è resistente ai farmaci.
Bang convinse Levin a passare un’estate al Marine Biological Laboratory di Woods Hole dove studiò le somiglianze tra gli amebociti di Limulus e le piastrine umane.
Dimostrò rapidamente che il plasma privo di cellule di un granchio a ferro di cavallo non si coagulava, ma quando studiò le cellule del sangue ebbe problemi a impedire che il sangue si coagulasse.
Ebbe anche un altro problema. I campioni che stavano bene quando lasciava il laboratorio la sera, erano coagulati quando tornava la mattina, e nessuno degli anti-coagulanti sul mercato faceva alcuna differenza.
La serendipità porta a un momento Aha!
Levin era sconcertato e stava diventando quasi disperato per capire questo!
Potrebbe essere dovuto ai batteri o a qualche componente dei batteri?
Per testare questa possibilità, ha preparato nuovi campioni in vetreria sterile, senza endotossine. Sorprendentemente, il sangue non coagulava!
Allora si rese conto di aver identificato un meccanismo di coagulazione del sangue che veniva innescato dalla presenza di endotossine batteriche gram-negative.
Finalmente, fu in grado di dimostrare che l’intero meccanismo di coagulazione del sangue nel Limulus era contenuto negli amebociti ed era estremamente sensibile alla presenza di endotossine.
Gli amebociti di Limulus polyphemus
“Penso che solo un ricercatore che stava lavorando con l’endotossina avrebbe mai considerato la possibilità che l’endotossina causasse la coagulazione del sangue di Limulus”, dice Levin.
Questo ha portato Levin a creare e brevettare il test estremamente sensibile Limulus Amebocyte Lysate (LAL), che potrebbe testare le endotossine batteriche usando il sangue di granchio a ferro di cavallo.
L’unico altro test per le endotossine all’epoca era chiamato Rabbit Pyrogen Test. All’epoca, la Food and Drug Administration degli Stati Uniti richiedeva che tutti i farmaci iniettabili dovessero superare il Pyrogen test prima di poter essere approvati per l’uso.
Tuttavia, il Rabbit Pyrogen Test era un processo costoso, inefficiente e spesso impreciso.
Si inietta il campione in un gruppo di conigli. Se ai conigli veniva la febbre, il farmaco non superava il test. Se non hanno avuto la febbre entro 4-6 ore, è passato.
Le aziende farmaceutiche dovevano ospitare migliaia di conigli per eseguire questi test.
Il test LAL può restituire un risultato in appena 45 minuti e può rilevare la presenza di endotossine a livelli inferiori a una parte per trilione.
Levin si rese conto di avere un test molto sensibile e rapido! Si trattava di una forte concorrenza per il test del coniglio.
Il test LAL può dare un risultato in appena 45 minuti e può rilevare la presenza di endotossine a livelli inferiori a una parte per trilione.
Anche se il test LAL è stato descritto per la prima volta nel 1965, ci sono voluti quasi 20 anni prima che il test fosse formalmente approvato dalla FDA come test per le endotossine dei prodotti finali!
Perché ci è voluto così tanto? Adottare il nuovo test più sensibile significava che le aziende farmaceutiche avrebbero dovuto riattrezzare e impostare un’intera nuova linea di produzione.
Questo è tempo e denaro!
Ma la crema alla fine sale in cima; questo test era la crema del raccolto e lo è ancora!
La domanda di LAL è ora così alta che è diventato uno dei liquidi più preziosi sulla Terra, con un prezzo riportato nell’aprile 2018 tra $ 35.000 e $ 60.000 per gallone!
Sviluppo del test LAL
Il test LAL è stato nominato uno dei “100 contributi più importanti alla salute pubblica” dalla Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health.
Secondo Jack Levin, è il test di screening standard per la contaminazione da endotossina in tutto il mondo, con circa 17,5 milioni di campioni testati (pari a circa 70 milioni di test eseguiti) ogni anno. È usato commercialmente per testare tutti i fluidi endovenosi, i farmaci parenterali e i dispositivi medici impiantabili prima del loro utilizzo sui pazienti.
Come viene fatto il LAL?
I granchi a ferro di cavallo sono catturati e un tubo viene infilato in loro per travasare il loro sangue (vedi foto sopra). Poi il sangue raccolto viene centrifugato per concentrare gli amebociti. Aggiungendo acqua agli amebociti concentrati, questi si rompono e rilasciano le proteine della coagulazione (il lisato) che reagiscono con le endotossine.
Questo modo di fare il LAL è propagandato come un metodo non letale per ottenere il sangue dal granchio. Ma non lo è. Perché non tutti i granchi sopravvivono!
Secondo la Atlantic State Marine Fisheries Commission, nel loro 2019 Horseshoe Crab Stock Benchmark Stock Assessment and Peer Review Report, 600.000 Horseshoe Crabs vengono catturati e dissanguati per soddisfare la domanda annuale di LAL.
Di quei 600.000 granchi, circa 420-540.000 (70-90 %) sopravvivono alla procedura. Se si aggiunge l’invasione dell’habitat, il riscaldamento globale e altri 500.000 + raccolti e uccisi ogni anno per essere usati come esca per la pesca di anguille e buccini, si può capire perché le popolazioni di granchi a ferro di cavallo stanno crollando.
Non solo, ma i granchi vengono raccolti in maggio e giugno quando vengono a riva in massa per accoppiarsi, deporre le uova e, si spera, mantenere la loro sopravvivenza.
Questa non è una situazione sostenibile!
Ci sono modi migliori per fare LAL?
“Il granchio a ferro di cavallo americano è sopravvissuto ai dinosauri ed è sopravvissuto a quattro precedenti estinzioni di massa, ma ora è minacciato dall’industria farmaceutica, dalle comunità di pescatori, dalla perdita di habitat, dal cambiamento climatico e, più recentemente, dalle soffocanti maree di alghe rosse al largo della costa orientale degli Stati Uniti.”Da Jonathan Watts in The Guardian
Ci sono due sforzi primari che vengono propagandati come modi per mitigare questa spiacevole situazione.
Un approccio provato dall’industria farmaceutica è l’acquacoltura di granchi a ferro di cavallo.
Inizialmente, i tentativi di coltivare granchi a ferro di cavallo non hanno avuto molto successo. Sembrava che dopo 3-4 mesi di coltura, le concentrazioni proteiche dell’emolinfa scendessero a livelli tali da provocare la mortalità. Si pensava che queste morti fossero legate a carenze nutrizionali.
Il dottor Anthony Dellinger è professore nel dipartimento di neuroscienze dell’Università del North Carolina a Greensboro e scienziato della Kepley Biosystems Incorporated, Greensboro, NC.
Dellinger e la KBI hanno lavorato duramente per sviluppare un nuovo sistema di acquacoltura migliorato. La loro premessa è che “la raccolta controllata di LAL da granchi a ferro di cavallo monitorati e ben mantenuti in acquacoltura potrebbe aumentare le quantità di fornitura di LAL, garantire la vitalità delle specie e consentire nuove innovazioni cliniche”
Se avesse successo, produrre maggiori volumi di LAL in modo affidabile, sostenibile ed economico gioverebbe sia alla natura che all’industria.
Dellinger e colleghi hanno descritto in dettaglio il funzionamento del loro sistema di acquacoltura in un documento pubblicato su Frontiers of Marine Science lo scorso aprile.
Guardiamo i punti salienti e i risultati di quello studio.
In primo luogo, hanno ottimizzato un sistema di acquacoltura interna a ricircolo che mantiene in modo affidabile i granchi a ferro di cavallo. Il loro obiettivo era quello di facilitare la raccolta ripetitiva di LAL mantenendo il benessere degli animali.
La prossima pietra miliare era quella di raggiungere un metodo per la raccolta ripetitiva a basso impatto. Per fare questo hanno impiantato chirurgicamente un catetere nel ferro di cavallo. Tutti i loro test hanno mostrato che i granchi a ferro di cavallo hanno tollerato abbastanza bene questi cateteri.
Ecco un rapido riassunto dei loro risultati.
Hanno raccolto e mantenuto 24 granchi per un anno con il 100% di sopravvivenza. I granchi a ferro di cavallo sono stati controllati per l’attività LAL, il rilascio di uova e sperma e altri segni che potrebbero indicare una salute compromessa. Non sono stati osservati tali segni.
I granchi sono stati dissanguati dai cateteri circa tre volte al mese, il che equivale potenzialmente a circa 36 sanguinamenti per granchio nel periodo di 12 mesi. Nessun problema dai cateteri impiantati è stato riscontrato in questo periodo di tempo.
Quando hanno calcolato i costi sostenuti, al di fuori del layout iniziale per il sistema di acquacoltura, il mantenimento dei granchi è venuto a circa $ 0,76 per libbra, un importo molto conveniente!
La domanda più importante a cui bisognava rispondere era:
Come si confronta il LAL dei granchi a ferro di cavallo mantenuti in casa con quello ottenuto dai granchi appena raccolti?
Come mostrato nella figura 6 del loro documento, non c’era alcuna differenza significativa nell’attività di coagulazione dell’endotossina LAL tra i granchi d’acquacoltura e quelli selvatici. E non c’era nemmeno alcuna differenza reale nell’attività dei sanguinamenti presi al giorno 1, 16 e 23.
Questi risultati li hanno portati a concludere,
“…l’acquacoltura potrebbe soddisfare le esigenze dell’industria per diversi anni con l’equivalente del 5-10% della cattura annuale di un anno, lasciando quasi 600.000 HSC in natura ogni anno in seguito. Infatti, questi risultati suggeriscono che ∼60.000 HSC di acquacoltura potrebbero essere dissanguati in modo sostenibile 12-24 volte all’anno e superare l’attuale domanda biomedica di LAL.”
Il secondo approccio elimina completamente il bisogno di granchi.
Jeak Ling Ding, insieme a suo marito e partner di ricerca Bow Ho, a Singapore, aveva un obiettivo: eliminare completamente il bisogno di granchi a ferro di cavallo.
Studiava il Carcinoscorpius rotundicauda, una specie asiatica molto più piccola dei ferri di cavallo atlantici, che non potevano essere dissanguati molto senza morire.
La ricerca di Ding sul LAL ha portato alla scoperta che una molecola chiamata fattore C era responsabile della sua azione coagulante. Ding ha isolato il gene del fattore C e ha usato un virus per inserirlo nelle cellule intestinali degli insetti. Questo essenzialmente ha trasformato gli insetti in piccole fabbriche che producevano il fattore C.
Gli insetti modificati producono quantità sufficienti di fattore C, che potrebbe poi essere venduto come fattore C ricombinante* (rFC) sul mercato come un valido sostituto del LAL.
* Note: The word recombinant is a term used in molecular genetics to indicate a gene that has been isolated (cloned) and inserted into another organism's DNA so that organism makes the protein that gene specifies. Using a virus is one of many ways to accomplish this.
Così ora, invece di raccogliere o acquacoltivare granchi a ferro di cavallo e dissanguarli, potrebbero coltivare grandi quantità di insetti e isolare l’rFC.
Le aziende farmaceutiche che hanno usato l’rFC hanno confermato che funziona altrettanto bene quanto il LAL e i costi di produzione sono comparabili.
“Eravamo così entusiasti come ricercatori, così felici che stesse funzionando”, ha detto Ding. “E pensavamo che il fattore C ricombinante sarebbe stato adottato in tutto il mondo e il granchio a ferro di cavallo sarebbe stato salvato.”
Purtroppo, l’rFC ha affrontato gli stessi ostacoli alla diffusione del LAL quando è stato introdotto. Anche se l’rFC è sul mercato dal 2003, è stato lento a guadagnare trazione. Ma a poco a poco sta superando gli ostacoli alla sua approvazione da parte della FDA. Originariamente solo un produttore lo produceva – l’azienda chimica svizzera Lonza Group.
Nel 2013, Hyglos GmbH è diventata la seconda azienda a produrre rFC. Kevin Williams, uno scienziato senior di Hyglos, dice che vede l’adozione e l’approvazione dell’rFC come una cosa attesa da tempo. Hyglos GmbH ha ottenuto l’approvazione per il suo uso da diverse agenzie di regolamentazione europee.
Oggi, gli esperti credono che alla fine, l’rFC diventerà il metodo dominante per rilevare le endotossine, lasciando i granchi a ferro di cavallo completamente fuori dalla produzione industriale.
Questo è qualcosa con cui i granchi a ferro di cavallo possono convivere!
Note: In these times of COVID-19, I wouldn't be surprised to see the obstacles removed even faster. Taking and applying research knowledge to improve patient wellbeing is happening faster than ever before. And in cases like this, that's a really good thing!
Che ci porta all’ultima domanda che voglio esaminare:
Perché ci interessa se i granchi a ferro di cavallo sopravvivono, comunque?
Non sono solo antiche reliquie di cui il nostro ecosistema moderno potrebbe facilmente fare a meno? Un sacco di altre specie si sono estinte e il pianeta sembra abbastanza a posto.
Questa è una domanda valida, quindi esaminiamola un po’ più a fondo.
La risposta istintiva è: “Certo che vogliamo salvarli!” Abbiamo abbastanza creature su questo pianeta già minacciate o che si sono già estinte. Non possiamo permetterci di perderne altre.
Come ho detto, questa è più una reazione istintiva, non una risposta su cui si può appendere il cappello. Per una risposta migliore, abbiamo bisogno di guardare come i granchi a ferro di cavallo si inseriscono nel quadro generale.
Iniziamo con ciò che mangiano e cosa li mangia.
Il granchio a ferro di cavallo adulto preda piccoli molluschi come la cozza blu e la vongola di mare, e vermi anellidi.
Al 2017, le cozze blu non sono in grave pericolo secondo questo rapporto del Safina Center della Stony Brook University. Lo stesso vale sia per gli anellidi che per le vongole di mare.
I giovani si nutrono di piccole particelle di materia algale e animale. Come l’animale cresce in dimensioni, così fa la preda che consuma.
Nell’insieme, sembra che i granchi a ferro di cavallo non stiano avendo effetti dannosi sulle loro specie preda.
Ok, questo è un lato della medaglia. E l’altra? Cosa mangia i granchi a ferro di cavallo?
Le uova del granchio a ferro di cavallo sono una fonte di cibo per molti organismi.
Questi includono uccelli della riva, alcuni pesci – spigole, pesciolini a strisce, silverside, passere – così come tartarughe marine, granchi e buccini. Sono una fonte di cibo critica per 11 specie di uccelli costieri migratori. La perdita di queste uova devasterebbe le popolazioni di questi uccelli.
Le tartarughe marine loggerhead e gli uccelli costieri come il nodo rosso dipendono dai granchi a ferro di cavallo.
Migliaia di queste tartarughe migrano nella baia di Chesapeake e Delaware in estate per nutrirsi dei granchi. Ora si pensa che i loggerheads stiano soffrendo a causa della mancanza di granchi a ferro di cavallo nel Chesapeake.
Alcuni aneddoti riportano che i granchi a ferro di cavallo compaiono nella pancia di alligatori e squali.
I giovani granchi a ferro di cavallo potrebbero anche essere un cibo chiave nella rete alimentare costiera. Durante l’estate e l’autunno, le larve e i primi stadi di vita dei granchi a ferro di cavallo sciamano nelle acque poco profonde. Questi bocconcini sono senza dubbio divorati dai pesci e dagli uccelli di terra.
E sembra che ci siano molti altri animali che li trovano molto appetibili e sarebbe difficile trovare facili sostituti.
Per una creatura che esiste da 450 milioni di anni, la nostra comprensione è lungi dall’essere completa sul ruolo che Limulus polyphemus gioca nell’ecosistema costiero.
Allo stato attuale della nostra conoscenza dell’ecologia dei granchi a ferro di cavallo, non possiamo arrivare a conclusioni definitive su quanto sia essenziale il loro ruolo. Quello che possiamo dire è che occupano sicuramente una nicchia che merita uno studio più serio.
Anche così, mi schiero dalla parte della necessità di conservarli! È il mio atteggiamento “meglio prevenire che curare”. Sappiamo troppo poco per lasciare che una specie come Limulus polyphemus ci scivoli tra le dita e scompaia, se possiamo impedirlo.
C’è qualcosa che puoi fare?
Se ti capita di vivere vicino a un posto dove i granchi a ferro di cavallo vengono a deporre le uova, è facile lanciarsi e aiutare. Ci sono programmi di lancio dei granchi e indagini sulla deposizione delle uova che si basano su volontari.
E infine, ricordati del granchio a ferro di cavallo quando vai dal dottore. Qualsiasi cosa iniettata o impiantata nel nostro corpo viene ancora testata per la contaminazione batterica gram-negativa con il LAL fatto con il sangue del granchio a ferro di cavallo.
Fino alla prossima volta
Rich
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Fonti di informazioni utilizzate per questo articolo:
- Il Granchio a Ferro di Cavallo
- L’acquacoltura del Granchio a Ferro di Cavallo come fonte sostenibile di test delle endotossine
- Il ruolo del Granchio a Ferro di Cavallo nell’industria biomedica e le recenti tendenze che influenzano la sostenibilità della specie
- Gli ultimi giorni della raccolta del sangue bluBlood Harvest
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- Il granchio a ferro di cavallo dell’Atlantico