AFLATOXINS : Occorrenza e rischi per la salute

Le aflatossine sono metaboliti tossici prodotti da alcuni funghi in/su alimenti e mangimi. Sono probabilmente le micotossine più conosciute e più intensamente studiate nel mondo. Le aflatossine sono state associate a varie malattie, come l’aflatossicosi, nel bestiame, negli animali domestici e negli esseri umani in tutto il mondo. La comparsa delle aflatossine è influenzata da alcuni fattori ambientali; quindi il grado di contaminazione varia con la posizione geografica, le pratiche agricole e agronomiche e la suscettibilità dei prodotti di base all’invasione fungina durante i periodi di pre-raccolta, stoccaggio e/o lavorazione. Le aflatossine hanno ricevuto maggiore attenzione di qualsiasi altra micotossina a causa del loro dimostrato effetto potenzialmente cancerogeno in animali da laboratorio suscettibili e dei loro effetti tossicologici acuti negli esseri umani. Poiché ci si rende conto che la sicurezza assoluta non è mai raggiunta, molti paesi hanno tentato di limitare l’esposizione alle aflatossine imponendo limiti normativi sui prodotti destinati all’uso come alimenti e mangimi.

Introduzione

Nel 1960 più di 100.000 giovani tacchini negli allevamenti di pollame in Inghilterra morirono nel corso di pochi mesi a causa di una malattia apparentemente nuova che fu definita “malattia X del tacchino”. Si scoprì presto che la difficoltà non era limitata ai tacchini. Anche anatroccoli e giovani fagiani furono colpiti e si registrò una forte mortalità.

Un’attenta indagine dei primi focolai mostrò che erano tutti associati ai mangimi, in particolare alla farina di arachidi brasiliana. Fu intrapresa un’indagine intensiva della farina di arachidi sospetta e si scoprì rapidamente che questa farina di arachidi era altamente tossica per il pollame e gli anatroccoli con sintomi tipici della malattia di Turkey X.

Le speculazioni fatte durante il 1960 sulla natura della tossina suggerirono che potesse essere di origine fungina. Infatti, il fungo produttore della tossina fu identificato come Aspergillus flavus (1961) e alla tossina fu dato il nome di Aflatossina in virtù della sua origine (A.flavis–>Afla).

Questa scoperta ha portato a una crescente consapevolezza dei potenziali pericoli di queste sostanze come contaminanti di cibo e mangimi che causano malattie e persino la morte negli esseri umani e in altri mammiferi. Gli studi che sono riassunti nelle sezioni seguenti hanno rivelato che le aflatossine sono prodotte principalmente da alcuni ceppi di A. Flavus e dalla maggior parte, se non tutti, i ceppi di A. parasiticus, più le specie correlate, A. nomius e A.niger. Inoltre, questi studi hanno anche rivelato che ci sono quattro principali aflatossine: B1, B2, G1, G2 più due prodotti metabolici aggiuntivi, M1 e M2, che sono importanti come contaminanti diretti di alimenti e mangimi. Le aflatossine M1 e M2 sono state isolate per la prima volta dal latte di animali in lattazione alimentati con preparazioni di aflatossine; da qui la denominazione M. Mentre la denominazione B delle aflatossine B1 e B2 deriva dall’esibizione della fluorescenza blu sotto la luce UV, mentre la denominazione G si riferisce alla fluorescenza giallo-verde delle relative strutture sotto la luce UV. Queste tossine hanno strutture strettamente simili e formano un gruppo unico di composti eterociclici altamente ossigenati, presenti in natura. Le loro formule molecolari stabilite da analisi elementari e determinazioni spettrometriche di massa sono:

• B1 : C17 H12 O6
• B2 : C17 H14 O6
• G1 : C17 H12 O7
• G2 : C17 H14 O7

Le aflatossine B2 e G2 sono state stabilite come derivati diidrossi di B1 e G1, rispettivamente. Mentre, l’aflatossina M1 è 4-idrossi aflatossina B1 e l’aflatossina M2 è 4-diidrossi aflatossina B2.

Occorrenza

Nei prodotti agricoli grezzi :

Le aflatossine si presentano spesso nelle colture in campo prima del raccolto. La contaminazione post-raccolta può verificarsi se l’essiccazione del raccolto è ritardata e durante l’immagazzinamento del raccolto se l’acqua è lasciata superare i valori critici per la crescita della muffa. Le infestazioni di insetti o roditori facilitano l’invasione delle muffe in alcuni prodotti immagazzinati.

Le aflatossine vengono rilevate occasionalmente nel latte, nel formaggio, nel mais, nelle arachidi, nei semi di cotone, nelle noci, nelle mandorle, nei fichi, nelle spezie e in una varietà di altri alimenti e mangimi. Latte, uova e prodotti a base di carne sono talvolta contaminati a causa del consumo da parte degli animali di mangimi contaminati da aflatossine. Tuttavia, i prodotti con il più alto rischio di contaminazione da aflatossina sono mais, arachidi e semi di cotone.

In alimenti trasformati :

Il mais è probabilmente il prodotto di maggiore preoccupazione a livello mondiale, perché viene coltivato in climi che possono avere una contaminazione perenne con aflatossine e il mais è l’alimento base di molti paesi. Tuttavia, le procedure utilizzate nella lavorazione del mais aiutano a ridurre la contaminazione del prodotto alimentare risultante. Questo perché, sebbene le aflatossine siano stabili o moderatamente stabili nella maggior parte dei processi alimentari, sono instabili in processi come quelli utilizzati nella produzione di tortillas che impiegano condizioni alcaline o fasi ossidanti. Le farine di mais e di semi di cotone contaminate da aflatossina nelle razioni lattiero-casearie hanno provocato la contaminazione del latte e dei prodotti lattiero-caseari con aflatossina M1, compresi il latte secco non grasso, il formaggio e lo yogurt.

Fattori che favoriscono la produzione di aflatossine

La crescita dei funghi e la contaminazione da aflatossine sono la conseguenza delle interazioni tra il fungo, l’ospite e l’ambiente. La combinazione appropriata di questi fattori determina l’infestazione e la colonizzazione del substrato, nonché il tipo e la quantità di aflatossina prodotta. Tuttavia, un substrato adatto è necessario per la crescita del fungo e la successiva produzione di tossine, anche se il fattore o i fattori precisi che danno inizio alla formazione della tossina non sono ben compresi. Lo stress idrico, lo stress da temperatura elevata e i danni provocati dagli insetti alla pianta ospite sono fattori determinanti nell’infestazione di muffe e nella produzione di tossine. Allo stesso modo, le fasi di crescita specifiche delle colture, la scarsa fertilità, l’alta densità delle colture e la concorrenza delle erbacce sono state associate a una maggiore crescita della muffa e alla produzione di tossine. La formazione di aflatossina è anche influenzata dalla crescita associata di altre muffe o microbi. Per esempio, la contaminazione preharvestaflatossina di arachidi e mais è favorita da temperature elevate, condizioni di siccità prolungate e alta attività degli insetti; mentre la produzione postharvest di aflatossine su mais e arachidi è favorita da temperature calde e alta umidità.

Aflatossicosi e salute animale

L’aflatossicosi è principalmente una malattia epatica. La suscettibilità dei singoli animali alle aflatossine varia considerevolmente a seconda della specie, dell’età, del sesso e dell’alimentazione. Infatti, le aflatossine causano danni al fegato, diminuzione della produzione di latte e uova, infezioni ricorrenti come risultato della soppressione dell’immunità (es. salmonellosi), oltre all’embriotossicità negli animali che consumano basse concentrazioni alimentari. Mentre i giovani di una specie sono più suscettibili, tutte le età sono colpite ma in gradi diversi per le diverse specie. I segni clinici dell’aflatossicosi negli animali comprendono disfunzioni gastrointestinali, ridotta riproduttività, ridotto utilizzo ed efficienza del mangime, anemia e ittero. Gli animali che allattano possono essere colpiti come risultato della conversione dell’aflatossina B1 nel metabolitaaflatoxin M1 escreto nel latte del bestiame da latte.

L’induzione del cancro da parte delle aflatossine è stata ampiamente studiata. L’aflatossina B1, l’aflatossina M1 e l’aflatossina G1 hanno dimostrato di causare vari tipi di cancro in diverse specie animali. Tuttavia, solo l’aflatossina B1 è considerata dall’Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro (IARC) come avente prove sufficienti di cancerogenicità negli animali da esperimento per essere identificata come cancerogena.

Aflatossine e salute umana

Gli esseri umani sono esposti alle aflatossine attraverso il consumo di alimenti contaminati con prodotti di crescita fungina. Tale esposizione è difficile da evitare perché la crescita fungina negli alimenti non è facile da prevenire. Anche se gli alimenti pesantemente contaminati non sono permessi sul mercato nei paesi sviluppati, rimane la preoccupazione per i possibili effetti avversi derivanti da una lunga esposizione a bassi livelli di aflatossine nell’alimentazione.
Evidenza di aflatossicosi acuta negli esseri umani è stata riportata da molte parti del mondo, in particolare dai paesi del terzo mondo, come Taiwan, Ouganda, India e molti altri. La sindrome è caratterizzata da vomito, dolore addominale, edema polmonare, convulsioni, coma e morte con edema cerebrale e coinvolgimento grasso del fegato, dei reni e del cuore.

Le condizioni che aumentano la probabilità di aflatossicosi acuta nell’uomo includono la disponibilità limitata di cibo, condizioni ambientali che favoriscono lo sviluppo dei funghi nei raccolti e nei prodotti di base e la mancanza di sistemi di regolamentazione per il monitoraggio e il controllo delle aflatossine.

Perché le aflatossine, specialmente l’aflatossina B1, sono potenti cancerogeni in alcuni animali, c’è interesse per gli effetti dell’esposizione a lungo termine a bassi livelli di queste importanti micotossine sull’uomo. Nel 1988, la IARC ha inserito l’aflatossina B1 nella lista dei cancerogeni umani. Questo è supportato da una serie di studi epidemiologici condotti in Asia e in Africa che hanno dimostrato un’associazione positiva tra aflatossine alimentari e cancro alle cellule del fegato (LCC). Inoltre, l’espressione delle malattie legate alle aflatossine nell’uomo può essere influenzata da fattori come l’età, il sesso, lo stato nutrizionale e/o l’esposizione concomitante ad altri agenti causali come l’epatite virale (HBV) o l’infestazione da parassiti.

Metodi recenti di analisi delle aflatossine in alimenti e mangimi

Campionamento e preparazione dei campioni :

Il campionamento e la preparazione dei campioni rimangono una notevole fonte di errore nell’identificazione analitica delle aflatossine. Pertanto, approcci sistematici al campionamento, alla preparazione del campione e all’analisi sono assolutamente necessari per determinare le aflatossine a livello di parti per miliardo. A questo proposito, sono stati sviluppati e testati rigorosamente piani specifici per alcuni prodotti come il mais, le arachidi e la frutta secca; i piani di campionamento per alcuni altri prodotti sono stati modellati su di essi. Una caratteristica comune a tutti i piani di campionamento è che l’intero campione primario deve essere macinato e mescolato in modo che la parte da analizzare abbia la stessa concentrazione di tossina del campione originale.

Estrazione in fase solida :

Tutte le procedure analitiche includono tre fasi: estrazione, purificazione e determinazione. Il miglioramento recente più significativo nella fase di purificazione è l’uso dell’estrazione in fase solida.
Gli estratti di prova vengono puliti prima dell’analisi strumentale (cromatografia a strato sottile o liquida) per rimuovere i materiali coestratti che spesso interferiscono con la determinazione degli analiti target.

Cromatografia a strato sottile :

La cromatografia a strato sottile (TLC), conosciuta anche come cromatografia a letto piano o cromatografia planare, è una delle tecniche di separazione più utilizzate nell’analisi delle aflatossine. Dal 1990, è stato considerato il metodo ufficiale AOAC e il metodo di scelta per identificare e quantificare le aflatossine a livelli bassi come 1 ng/g. Il metodo TLC è anche usato per verificare i risultati con tecniche più nuove e rapide.

Cromatografia liquida :

La cromatografia liquida (LC) è simile alla TLC per molti aspetti, compresa l’applicazione dell’analita, la fase stazionaria e la fase mobile. La cromatografia ligure e la TLC si completano a vicenda. Non è insolito che un analista utilizzi la TLC come lavoro preliminare per ottimizzare le condizioni di separazione della LC.
I metodi di cromatografia liquida per la determinazione delle aflatossine negli alimenti comprendono LC in fase normale (NPLC), LC in fase inversa (RPLC) con pre o prima della derivatizzazione della colonna (BCD), RPLC seguita da derivatizzazione postcolonna (PCD) e RPLC con rilevamento elettrochimico.

Metodi immunochimici :

La cromatografia su strato sottile e i metodi LC per determinare le aflatossine negli alimenti sono laboriosi e richiedono tempo. Spesso, queste tecniche richiedono conoscenza ed esperienza delle tecniche cromatografiche per risolvere problemi di separazione e interferenza. Grazie ai progressi nella biotecnologia, sono ora disponibili in commercio test altamente specifici basati su anticorpi che possono identificare e misurare le aflatossine negli alimenti in meno di 10 minuti. Questi test sono basati sull’affinità degli anticorpi monoclonali o policlonali per le aflatossine. I tre tipi di metodi immunochimici sono il dosaggio radioimmunologico (RIA), il dosaggio immunoassorbente legato all’enzima (ELISA) e il dosaggio su colonna di immunoaffinità (ICA).

Conferma dell’identità delle aflatossine:

Anche se i metodi analitici possono consistere in diverse fasi di estrazione, pulizia e quantificazione, i risultati delle analisi con tali metodi dovrebbero essere simili quando i metodi sono applicati correttamente. Poiché l’affidabilità dei dati quantitativi non è in discussione, il problema ancora da risolvere è la conferma dell’identità delle aflatossine. Le tecniche di conferma utilizzate coinvolgono la derivatizzazione chimica o la spettrometria di massa (MS).

Problemi di sicurezza nella manipolazione di grani ammuffiti e aflatossine :

La sicurezza è una questione chiave per gli scienziati che lavorano nell’area delle aflatossine.Bisogna prendere provvedimenti per minimizzare l’esposizione alle tossine e ai microorganismi produttori, Aspergillus flavus e Aspergillusparasiticus. Un programma di sicurezza dovrebbe essere stabilito che soddisfa therequirements dello standard di laboratorio del Occupational Safety andHealth Administration (1990) e le linee guida del National Institutesof Health (1981) che copre l’uso di agenti chimici cancerogeni.

Tecniche di monitoraggio per la valutazione dell’esposizione umana alle aflatossine

Negli ultimi anni, sono state sviluppate nuove tecnologie che monitorano in modo più accurato le esposizioni individuali alle aflatossine. Particolare attenzione è stata dedicata all’analisi degli addotti del DNA dell’aflatossina e degli addotti dell’albumina come surrogati della genotossicità nelle persone. Autrup et al.(1983) hanno aperto la strada all’uso della spettroscopia di fluorescenza sincrona per la misurazione degli addotti del DNA delle aflatossine nelle urine. I campioni di urina raccolti dopo l’esposizione alle alfatossine sono risultati contenere 2,3-diidrossi-2-(N7-guanil)-3-idrossiaflatossinaB1, banalmente conosciuta come AFB-Gual. Wild et al.(1986) hanno usato saggi immunologici altamente sensibili per quantificare le aflatossine nei fluidi corporei umani. Un test immunosorbente legato all’enzima (ELISA) è stato utilizzato per quantificare l’aflatossina B1 nell’intervallo da 0,01 ng /ml a 10 ng/ml, ed è stato convalidato in campioni di urina umana. Utilizzando questo metodo, l’escrezione dell’addotto aflatossina-DNA nelle urine è risultata positivamente correlata all’assunzione con la dieta, e l’addotto majororaflatossina B1-DNA escreto nelle urine ha dimostrato di essere un addotto appropriato per il monitoraggio dell’esposizione alimentare all’aflatossina.

Controllo e gestione delle aflatossine

A- Controllo normativo:

Le aflatossine sono considerate contaminanti inevitabili di alimenti e mangimi, anche quando sono state seguite le buone pratiche di produzione. La FDA ha stabilito delle linee guida specifiche sui livelli accettabili di aflatossine negli alimenti per l’uomo e nei mangimi, stabilendo dei livelli d’azione che permettono la rimozione dei lotti violenti dal commercio. Il livello di azione per gli alimenti umani è di 20 ppb di aflatossine totali, ad eccezione del latte che ha un livello di azione di 0,5 ppb per l’aflatossina M1. Anche il livello d’azione per la maggior parte dei mangimi è di 20 ppb. Tuttavia, è molto difficile stimare accuratamente la concentrazione di aflatossine in una grande quantità di materiale a causa della variabilità associata alle procedure di test; di conseguenza, la vera concentrazione di aflatossine in un lotto non può essere determinata con il 100% di certezza.

B- Strategie di disintossicazione:

Poiché la contaminazione da aflatossine è inevitabile, sono state proposte numerose strategie di disintossicazione. Queste includono la separazione fisica, l’inattivazione termica, l’irradiazione, l’estrazione con solventi, l’adsorbimento dalla soluzione, l’inattivazione microbica e la fermentazione. I metodi chimici di disintossicazione sono anche praticati come una strategia importante per la disintossicazione efficace:

Degradazione strutturale dopo il trattamento chimico:
Un diverso gruppo di sostanze chimiche è stato testato per la capacità di degradare e inattivare le aflatossine. Un certo numero di queste sostanze chimiche può reagire per distruggere (o degradare) le aflatossine in modo efficace, ma la maggior parte è poco pratica o potenzialmente insicura a causa della formazione di residui tossici o della perturbazione del contenuto di nutrienti e delle proprietà organolettiche del prodotto. Due approcci chimici alla disintossicazione delle aflatossine che hanno ricevuto notevole attenzione sono l’ammoniaca e la reazione con il bisolfito di sodio.
Molti studi forniscono prove che il trattamento chimico tramite l’ammoniaca può fornire un metodo efficace per disintossicare il mais e altri prodotti contaminati da aflatossine. Il meccanismo di questa azione sembra coinvolgere l’idrolisi dell’anello lattonico e la conversione chimica del composto genitore aflatossina B1 in numerosi prodotti che mostrano una tossicità notevolmente diminuita.
D’altra parte, il bisolfito di sodio ha dimostrato di reagire con le aflatossine (B1, G1 e M1) in varie condizioni di temperatura, concentrazione e tempo per formare prodotti solubili in acqua.

Modificazione della tossicità da parte di sostanze chimiche alimentari:
La tossicità delle micotossine può essere fortemente influenzata da sostanze chimiche alimentari che alterano le normali risposte dei sistemi dei mammiferi a queste sostanze.Una serie variabile di fattori chimici, compresi i componenti nutrizionali (ad esempio proteine e grassi alimentari, vitamine e oligoelementi), additivi alimentari e mangimi (ad esempio antibiotici e conservanti), nonché altri fattori chimici possono interagire con gli effetti delle aflatossine negli animali.

Alterazione della biodisponibilità da parte dei chemisorbenti per aflatossine :
Un nuovo approccio alla disintossicazione delle aflatossine è l’aggiunta di materiali sorbenti inorganici, noti come chemisorbenti, come l’alluminosilicato di calcio idratato (HSCAS) alla dieta degli animali. L’HSCAS possiede la capacità di legare strettamente e immobilizzare le aflatossine nel tratto gastrointestinale degli animali, con conseguente importante riduzione della biodisponibilità delle aflatossine.

Impatto economico delle aflatossine

L’impatto economico delle aflatossine deriva direttamente dalle perdite di raccolto e di bestiame e indirettamente dal costo dei programmi di regolamentazione progettati per ridurre i rischi per la salute animale e umana. L’Organizzazione per l’Alimentazione e l’Agricoltura (FAO) stima che il 25% delle colture alimentari mondiali sono affette da micotossine, di cui le più note sono le aflatossine. Le perdite di aflatossine per il bestiame e i produttori di pollame derivanti da mangimi contaminati da aflatossine includono la morte e gli effetti più sottili di soppressione del sistema immunitario, tassi di crescita ridotti e perdite di efficienza alimentare. Altri effetti economici negativi delle aflatossine includono rese inferiori per le colture di cibo e fibre.

Inoltre, la capacità delle aflatossine di causare cancro e malattie correlate negli esseri umani, data la loro presenza apparentemente inevitabile negli alimenti e nei mangimi, rende la prevenzione e la detossificazione di queste micotossine uno dei problemi tossicologici più impegnativi del tempo presente.

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