negli anni 60, due pietre miliari furono raggiunte nella fisiologia dell’assorbimento intestinale dello zucchero. La prima fu l’ipotesi del cotrasporto Na+-glucosio di Crane e colleghi (1), che spiegava il trasporto attivo dello zucchero, e la seconda fu la scoperta del malassorbimento di glucosio e galattosio (GGM) nei pazienti (5, 6). L’ipotesi del cotrasporto è stata esaustivamente testata, confermata ed estesa per includere il “trasporto attivo” di un’ampia varietà di substrati nelle cellule, dall’accumulo di lattosio in Escherichia coli all’accumulo di ioduro nella tiroide. Essenzialmente, i cotrasportatori sono macchine molecolari che utilizzano l’energia immagazzinata sotto forma di gradienti di potenziale elettrochimico di ioni attraverso le membrane cellulari, Na+ o H+, per guidare l’accumulo di specifici soluti e acqua nelle cellule (22). Il cotrasportatore intestinale Na+-glucosio (SGLT1) usa il Na+ e i gradienti elettrici attraverso la membrana per portare zucchero e acqua negli enterociti contro i loro gradienti di concentrazione (9, 13, 23). Il glucosio e il galattosio sono entrambi gestiti da SGLT1, mentre il fruttosio è trasportato attraverso il confine a spazzola dal proprio trasportatore privato, il trasportatore facilitato di fruttosio (GLUT5). Glucosio, galattosio e fruttosio completano il loro viaggio attraverso la cellula nel sangue attraverso un altro trasportatore facilitato di zucchero (GLUT2) nella membrana basolaterale (Fig.1).

La MGG è caratterizzata dall’insorgenza neonatale di diarrea acquosa e acida grave, che è fatale entro poche settimane a meno che il lattosio (glucosio e galattosio) sia rimosso dalla dieta (2). La diarrea cessa con il digiuno o il ritiro degli zuccheri incriminati dalla dieta, ma riprende prontamente con l’alimentazione orale di diete contenenti lattosio, glucosio o galattosio. L’assorbimento del fruttosio non è influenzato. Dati i sintomi della malattia e ciò che era noto sull’assorbimento intestinale dello zucchero al momento, è stato previsto che GGM era dovuto a un difetto nel cotrasportatore a spazzola Na + glucosio. Questa ipotesi è stata rafforzata dalla squisita captazione autoradiografica del galattosio e dagli esperimenti di legame della florizina fatti sulle biopsie della mucosa del primo paziente americano con GGM (17, 18). Questi esperimenti hanno mostrato che la riduzione del trasporto del galattosio era associata a una diminuzione del 90% del legame della florizina al bordo della spazzola. La florizina è un inibitore specifico, non trasportato, competitivo di SGLT1.

Il test diagnostico più affidabile per la GGM è il test del respiro H2 (Fig.2). La somministrazione orale di glucosio o galattosio (2 g/kg) provoca un aumento dell’H2 nel respiro molto superiore a 20 parti/milione nei pazienti con GGM, ma nessun aumento simile nei controlli o nei pazienti nutriti con fruttosio. I bambini con GGM prosperano “normalmente” con formule sostitutive del fruttosio, ma i sintomi ritornano anche in età adulta con appena un cucchiaino di glucosio (6 g), e il test del respiro H2 rimane positivo. La malattia è abbastanza rara. Siamo a conoscenza di circa 200 pazienti in tutto il mondo, e un’alta percentuale di casi proviene da relazioni consanguinee.

La fisiologia e la fisiopatologia dell’assorbimento intestinale dello zucchero sono state avanzate nel 1987 dalla nostra clonazione del cotrasportatore Na+-glucosio del coniglio con una nuova strategia che abbiamo chiamato “clonazione di espressione”. Questo successo è stato rapidamente seguito dalla clonazione di Turk e Hediger (4) del cotrasportatore umano di Na+-glucosio e dall’identificazione da parte di Turk et al. (20) della prima mutazione in un trasportatore che causa una malattia genetica, la GGM. Abbiamo ottenuto biopsie intestinali da due sorelle con diagnosi di GGM e campioni di sangue dei genitori che sono cugini. Turk et al. (20) hanno identificato una mutazione omozigote missenso (Asp28Asn) nel cDNA di SGLT1 di ogni sorella, hanno scoperto che ogni genitore era portatore di questa mutazione e hanno dimostrato che la mutazione ha completamente abolito il cotrasporto Na+-glucosio usando un saggio di espressione ovocitaria. Nella stessa parentela, lo screening prenatale è stato successivamente effettuato su due feti e uno (fratello del probando) è risultato essere un portatore della mutazione Asp28Asn e l’altro (un cugino) è risultato essere normale. Entrambi i bambini hanno prosperato senza restrizioni dietetiche e sono rimasti asintomatici per almeno due anni (11).

L’ulteriore progresso è stato inizialmente ostacolato dalla difficoltà di ottenere campioni di biopsia della mucosa da bambini con GGM fino a quando Turk et al. (21) sono riusciti a mappare l’intero gene umano SGLT1. Il gene è grande, con 15 esoni distribuiti su 72 kb di DNA. Una volta sequenziati gli esoni e le loro regioni adiacenti, è stato sviluppato un test di polimorfismo conformazionale a singolo filamento per lo screening dei pazienti per le mutazioni utilizzando il DNA genomico da un piccolo campione di sangue. Questo sviluppo ha comportato l’amplificazione PCR di ciascuno dei 15 esoni e delle loro giunzioni introne-esone e l’elettroforesi su gel dei prodotti PCR denaturati per identificare gli esoni che portano mutazioni. Gli esoni anomali sono stati poi sequenziati. Per determinare se le mutazioni erano responsabili del difetto nel trasporto dello zucchero, i mutanti sono stati espressi in oociti di Xenopus laevis per saggi di assorbimento del Na+-glucosio. Martı́n (Rif. 10, 12, e osservazioni non pubblicate) è stato ampiamente responsabile di questa fase del progetto. Le mutazioni responsabili della malattia sono state identificate in 33 dei 34 pazienti GGM esaminati. I pazienti di 17 razze portavano mutazioni omozigoti e, in altre 10 razze, i pazienti avevano mutazioni eterozigoti composte. Queste includevano 22 mutazioni missenso (vedi Fig.3) e 4 mutazioni splice-site e 3 mutazioni nonsense che portano alla produzione di una proteina SGLT1 gravemente troncata. Il mancato rilevamento di mutazioni nel 34° paziente può essere dovuto al fatto che la mutazione si trovava nella regione del promotore del gene e il DNA di quest’area non è stato incluso nella procedura di screening.

Come fisiologo del trasporto, mi sono interessato alle mutazioni missenso GGM per il loro potenziale nell’identificazione dei residui nella proteina critici per il trasporto. Abbiamo quindi deciso di determinare come le mutazioni missenso causano effettivamente il difetto nel trasporto di Na+-zucchero. In questo approccio, realizzato in gran parte da Lostao (vedi Rif. 10 e 12), le proteine mutanti in X. laevisoociti sono state espresse e poi sono stati utilizzati metodi biofisici e biochimici per determinare il livello di proteina nella cellula e nella membrana plasmatica. Nei casi in cui il trasportatore era inserito nella membrana plasmatica, abbiamo (7) esaminato le reazioni parziali del ciclo di trasporto. Inizialmente siamo rimasti delusi nel constatare che con i primi 21 mutanti missenso studiati il difetto primario era dovuto al mistrafficking dei trasportatori nella cellula. Sulla base dei Western blot, tutti i mutanti erano sintetizzati a livelli simili o superiori a quelli delle SGLT wild-type. Tuttavia, le misure di carica (7) e la microscopia elettronica a liofilizzazione (24) della membrana plasmatica dell’ovocita hanno dimostrato che c’era una grave riduzione del numero di cotrasportatori nella membrana plasmatica (10, 12). Come giudicato dal grado di core e complex glycosylation dei mutanti, il difetto nel traffico di SGLT1 alla membrana plasmatica si è verificato tra il reticolo endoplasmatico e il Golgi o il Golgi e la membrana plasmatica. Il cattivo ripiegamento delle proteine mutanti può essere la causa principale del mancato trasporto del trasportatore (19). In un solo caso, Gln457Arg, la proteina mutante era nella membrana plasmatica dell’ovocita vicino a livelli normali.

Quale rilevanza hanno questi esperimenti sugli ovociti nell’intestino dei pazienti GGM? Per rispondere a questo, abbiamo esaminato (dati non pubblicati) la distribuzione della proteina SGLT1 tramite immunocitochimica nelle biopsie della mucosa di tre pazienti con mutazioni omozigoti. In tutti e tre, la distribuzione delle proteine mutanti nell’ovocita era identica alla distribuzione di SGLT1 negli enterociti del paziente: in due la proteina era nel citoplasma, e in uno la proteina era nel brush border. C’è anche accordo tra i nostri risultati sugli ovociti e quelli ottenuti dagli studi autoradiografici delle biopsie del primo paziente americano con GGM (18). Stirling e i suoi collaboratori (18) hanno trovato che il legame della florizina al brush border del paziente era ridotto del 90%, e noi non abbiamo trovato nessuna proteina SGLT1 mutante (Cys355Ser e Leu147Arg) nella membrana plasmatica degli ovociti (10). Questi studi suggeriscono che, almeno con questi quattro mutanti GGM, l’ovocita ricapitola il comportamento della proteina mutante nell’enterocita.

Una grande domanda rimanente è come le mutazioni missenso distribuite in tutta la proteina (Fig. 3) disturbano il traffico del trasportatore alla membrana plasmatica. Le risposte a questa domanda sono importanti per comprendere la biosintesi delle proteine della membrana plasmatica e per ideare terapie migliori per i bambini con GGM.

La mutazione GGM in una razza, Gln457Arg, ha fornito una comprensione inestimabile del meccanismo del trasporto dello zucchero. Lostao ha studiato (in preparazione) il comportamento di Q457R SGLT1 espresso negli ovociti e nella mucosa intestinale del paziente e ha scoperto che la proteina viene tradotta, glicosilata e inserita nella membrana plasmatica, ma non è in grado di trasportare zucchero. In assenza di zucchero, la proteina mutante trasporta Na+ attraverso la fuga di Na+ o la via dell’uniporto di Na+, e questo è bloccato dalla florizina. Anche il glucosio è un inibitore perché blocca anche questa via di trasporto del Na+, indicando che il glucosio si lega a Q457R SGLT1 ma che non viene trasportato, cioè la mutazione produce un difetto di traslocazione dello zucchero. Panayotova-Heiermann e colleghi (15) hanno dimostrato indipendentemente che il “poro” dello zucchero attraverso SGLT1 è formato dal dominio COOH-terminale di SGLT1 che porta il residuo Q457.

Per sfruttare queste osservazioni abbiamo esaminato il ruolo di Q457 nella traslocazione dello zucchero. In questo studio, il mutante cisteina Q457C è stato trovato per mantenere piena attività di trasporto Na+-glucosio, a parte un aumento della costante di Michaelis-Menten apparente del glucosio (Km) da 0,4 a 6 mM, e la mutagenesi chimica di Q457C con reagenti alchilanti carichi o neutri (metanethiosulfonate, MTS) è stata trovata per bloccare completamente il trasporto dello zucchero. Tuttavia, poiché la proteina alchilata Q457C lega il glucosio con una costante di dissociazione molto simile al Km apparente per il trasporto dello zucchero da parte di Q457C SGLT1, questo residuo non deve far parte del sito di legame dello zucchero. L’inibizione del trasporto di zucchero da parte di Q457C tramite MTS si è verificata solo quando il cotrasportatore era nella conformazione Na+ rivolta verso l’esterno, C2 (Fig.4). Il reagente non era efficace in assenza di Na+, in presenza di Na+ e glucosio (o florizina), o in presenza di Na+ a potenziali di membrana depolarizzati. Esperimenti di salto di tensione con rodamina marcato Q457C hanno anche mostrato che il corso del tempo e il livello di fluorescenza ha seguito da vicino la transizione del cotrasportatore tra le conformazioni C2 e C6 (Fig. 4). Interpretiamo questi risultati nel senso che il cotrasportatore può esistere in almeno tre diverse conformazioni (C6, C2 e C3) e che l’accoppiamento tra Na+ e trasporto dello zucchero avviene attraverso cambiamenti conformazionali indotti dal ligando e dalla tensione nella proteina.

Studi preliminari con altre due mutazioni missense GGM nel dominio COOH-terminale di SGLT1, A468V e R499H (Fig. 3), mostrano che la sostituzione dei residui con cisteine ripristina il traffico della proteina verso la membrana plasmatica dell’ovulo. Entrambe le proteine sono funzionali, e il trasporto dello zucchero è bloccato dai reagenti MTS. Come nel caso di Q457C, questi residui sono accessibili ai reagenti MTS solo quando le proteine sono nella conformazione C2. Questi risultati supportano la mia opinione che le eliche transmembrana 10-13 (Fig. 3) formano il poro dello zucchero. Ulteriori lavori sono necessari per identificare il poro Na+.

In sintesi, gli studi di biologia molecolare sulla SGLT1 hanno portato alla clonazione del cDNA della SGLT1 umana e alla mappatura del gene, che hanno fornito nuovi potenti strumenti per esaminare la fisiologia del cotrasporto Na+-glucosio e per studiare la GGM. È stato confermato che la GGM è dovuta a mutazioni nel gene SGLT1, e la maggior parte di queste mutazioni risultano in una proteina SGLT1 troncata o in un mistrafficking del trasportatore nella cellula. Come previsto per una malattia autosomica recessiva, una mutazione privata produce la malattia in ogni parentela e la frequenza della malattia aumenta nelle culture con un’alta frequenza di matrimoni consanguinei. Anche se la GGM è rara, è possibile che il pool più ampio di individui portatori di mutazioni SGLT1 lievi, o gravi mutazioni su un allele, abbia un assorbimento alterato di glucosio e galattosio. Circa il 10% della popolazione normale, studenti di medicina, ha dato test di glucosio H2 breath positivo (14). Questa interfaccia tra fisiologia e malattia non solo ha aumentato la comprensione della fisiopatologia dell’assorbimento dello zucchero, ma ha fornito nuovi approcci per studiare i meccanismi molecolari dell’accoppiamento tra Na+ e trasporto dello zucchero attraverso le membrane plasmatiche.

FOOTNOTES

• * Primo di una serie di articoli su invito sui disturbi genetici del trasporto di membrana.