ImmunoistochimicaModifica

Immunohistochemistry o colorazione IHC di sezioni di tessuto (o immunocitochimica, che è la colorazione delle cellule), è forse la tecnica di immunostaining più comunemente applicata. Mentre i primi casi di colorazione IHC utilizzavano coloranti fluorescenti (vedi immunofluorescenza), ora vengono utilizzati altri metodi non fluorescenti che utilizzano enzimi come la perossidasi (vedi colorazione immunoperossidasi) e la fosfatasi alcalina. Questi enzimi sono in grado di catalizzare reazioni che danno un prodotto colorato che è facilmente rilevabile al microscopio ottico. In alternativa, elementi radioattivi possono essere usati come etichette, e l’immunoreazione può essere visualizzata tramite autoradiografia.

La preparazione o la fissazione del tessuto è essenziale per la conservazione della morfologia cellulare e dell’architettura del tessuto. Una fissazione inappropriata o prolungata può diminuire significativamente la capacità di legame degli anticorpi. Molti antigeni possono essere dimostrati con successo in sezioni di tessuto fissate in formalina con inclusione di paraffina. Tuttavia, alcuni antigeni non sopravvivono nemmeno a quantità moderate di fissazione con aldeidi. In queste condizioni, i tessuti dovrebbero essere rapidamente congelati in azoto liquido e tagliati con un criostato. Gli svantaggi delle sezioni congelate includono la scarsa morfologia, la scarsa risoluzione agli ingrandimenti più elevati, la difficoltà di tagliare sopra le sezioni di paraffina e la necessità di conservare il materiale congelato. In alternativa, le sezioni con vibratomo non richiedono che il tessuto sia trattato con solventi organici o con calore elevato, che possono distruggere l’antigenicità, o che sia interrotto dallo scongelamento. Lo svantaggio delle sezioni con vibratomo è che il processo di sezionamento è lento e difficile con tessuti morbidi e mal fissati, e che i segni di vibrazione o le linee del vibratomo sono spesso evidenti nelle sezioni.

Il rilevamento di molti antigeni può essere notevolmente migliorato da metodi di recupero dell’antigene che agiscono rompendo alcuni dei legami incrociati delle proteine formati dalla fissazione per scoprire siti antigenici nascosti. Questo può essere realizzato riscaldando per tempi variabili (heat induced epitope retrieval o HIER) o usando la digestione enzimatica (proteolytic induced epitope retrieval o PIER).

Una delle principali difficoltà con la colorazione IHC è superare il background specifico o non specifico. L’ottimizzazione dei metodi e dei tempi di fissazione, il pre-trattamento con agenti bloccanti, l’incubazione degli anticorpi con sale elevato e l’ottimizzazione dei buffer di lavaggio post-anticorpo e dei tempi di lavaggio sono tutti importanti per ottenere un’immunocolorazione di alta qualità. Inoltre, la presenza di controlli positivi e negativi per la colorazione sono essenziali per determinare la specificità.

Citometria a flussoModifica

Un citometro a flusso può essere utilizzato per l’analisi diretta delle cellule che esprimono una o più proteine specifiche. Le cellule sono colorate in soluzione con metodi simili a quelli usati per l’immunofluorescenza, e poi analizzate con la citometria a flusso.

La citometria a flusso ha diversi vantaggi rispetto all’IHC, tra cui: la capacità di definire popolazioni di cellule distinte in base alla loro dimensione e granularità; la capacità di eliminare le cellule morte; una maggiore sensibilità; e l’analisi multicolore per misurare diversi antigeni contemporaneamente. Tuttavia, la citometria a flusso può essere meno efficace nel rilevare popolazioni di cellule estremamente rare, e c’è una perdita di relazioni architettoniche in assenza di una sezione di tessuto. La citometria a flusso ha anche un alto costo di capitale associato all’acquisto di un citometro a flusso.

Western blottingModifica

Il Western blotting permette il rilevamento di proteine specifiche da estratti fatti da cellule o tessuti, prima o dopo qualsiasi fase di purificazione. Le proteine sono generalmente separate per dimensione usando l’elettroforesi su gel prima di essere trasferite su una membrana sintetica tramite metodi di blotting secco, semi-secco o umido. La membrana può poi essere analizzata con anticorpi usando metodi simili all’immunoistochimica, ma senza bisogno di fissazione. La rilevazione è tipicamente eseguita usando anticorpi legati alla perossidasi per catalizzare una reazione chemiluminescente.

Western blotting è un metodo di biologia molecolare di routine che può essere usato per confrontare semi-quantitativamente i livelli di proteine tra estratti. La separazione delle dimensioni prima del blotting permette di misurare il peso molecolare della proteina rispetto a marcatori di peso molecolare noti.

Saggio immunosorbente legato ad un enzimaModifica

Il saggio di immunoassorbimento enzimatico o ELISA è un metodo diagnostico per determinare quantitativamente o semiquantitativamente le concentrazioni di proteine dal plasma sanguigno, dal siero o da estratti di cellule/tessuti in un formato di piastra a più pozzetti (solitamente 96 pozzetti per piastra). In generale, le proteine in soluzione sono adsorbite sulle piastre ELISA. Gli anticorpi specifici per la proteina di interesse sono usati per sondare la piastra. Lo sfondo è minimizzato ottimizzando i metodi di blocco e di lavaggio (come per l’IHC), e la specificità è garantita dalla presenza di controlli positivi e negativi. I metodi di rilevazione sono solitamente colorimetrici o basati sulla chemiluminescenza.

Microscopia immunoelettronicaModifica

La microscopia elettronica o EM può essere utilizzata per studiare la microarchitettura dettagliata di tessuti o cellule. L’immuno-EM permette la rilevazione di proteine specifiche in sezioni ultrasottili di tessuto. Gli anticorpi etichettati con particelle di metalli pesanti (ad esempio oro) possono essere visualizzati direttamente utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione. Anche se potente nel rilevare la localizzazione subcellulare di una proteina, l’immuno-EM può essere tecnicamente impegnativo, costoso, e richiede una rigorosa ottimizzazione dei metodi di fissazione e trattamento dei tessuti. La biotinilazione delle proteine in vivo è stata proposta per alleviare i problemi causati dalla frequente incompatibilità della colorazione degli anticorpi con i protocolli di fissazione che preservano meglio la morfologia cellulare.