Clostridium botulinum – Botulismo (forme cliniche). Test per la diagnosi del botulismo. Rilevamento della tossina in pazienti, alimenti, mangimi, fanghi o sedimenti acquatici; uccelli acquatici, altri campioni. Test raccomandati: rilevazione della tossina, coltura di C. botulinum, tossina botulinica tipizzata; diagnosi molecolare (PCR).

Caratteristiche del Clostridium botulinum e della tossina botulinica

Clostridium botulinum è un bacillo grampositivo anaerobio stretto, genere Clostridium, famiglia Clostridiaceae, formante spore, che produce una tossina neurotossica. Questo batterio si trova di solito nel suolo e nell’acqua dolce non trattata e nei sedimenti (oceani, laghi), con una distribuzione mondiale. In alcune circostanze questo organismo può contaminare il cibo e crescere in esso per produrre la sua/e tossina/e. Il botulismo, una forma grave di intossicazione alimentare, risulta dall’ingestione di cibo contenente la tossina. Anche se questa malattia è rara, il tasso di mortalità è alto. Quando il tipo di tossina è stato determinato tra 1036 casi rilevati negli Stati Uniti tra il 1899 e il 1990, 384 erano dovuti alla tossina A, 106 alla tossina B, 105 alla tossina E e 3 alla tossina F. A volte possono esserci casi dovuti a due tossine, per esempio A e B.

Tutte le forme di botulismo umano o animale, sono causate dall’assorbimento della tossina botulinica formata durante la moltiplicazione del batterio Clostridium botulinum. La tossina ha una tossicità (neurotossicità) molto elevata, per cui esercita la sua azione a livelli estremamente bassi, è termolabile, mentre le spore del batterio sono resistenti al calore e sopravvivono in alimenti riscaldati a più di 100ºC, come le conserve sotto trattamento termico. Inoltre, alcuni ceppi di C. botulinum, C. butyricum, C. baratii e C. argentinense possono produrre neurotossine botuliniche. I tipi A, B, E e F sono le cause principali del botulismo umano, mentre i tipi C e D si trovano nei casi di botulismo animale, i più colpiti sono uccelli selvatici e pollame, bovini, cavalli e alcune specie di pesci. I tipi A e B sono i più comuni negli uomini, e sono principalmente legati alla contaminazione di verdure in scatola preparate in casa, ma in Europa questi tipi sono stati trovati anche in relazione a prodotti di carne. Il tipo E (pesce) si trova negli ambienti acquatici e si correla con i casi di botulismo E relativi a pesce o molluschi contaminati, ed è in aumento. Il tipo F è eccezionale. Il tipo C si suddivide in C1 (neurotossina) e C2 (non neurotossina, colpisce la permeabilità vascolare ed è enterotossigeno). Il tipo G è prodotto da C. argentiniense (isolato da terra in Argentina, siero di pazienti deceduti, anche se non è chiaro il coinvolgimento).

Le tossine sono sintetizzate durante la crescita del batterio come una proteina inattiva (150 kDa), che viene rilasciato dai batteri durante la lisi. Per attivare la tossina formata dovrebbe degradarsi in due catene polipeptidiche (50 e 100 kDa).

C. botulinum, può differenziarsi in gruppi secondo le loro caratteristiche culturali, biochimiche e fisiologiche. Tutte le colture di tipo A e alcune del tipo B e F sono proteolitiche. Le colture di tossine di C. botulinum prodotte da C e D non sono proteolitiche, quando coltivate in un mezzo con albume coagulato o carne. Tutti i tipi E e alcuni del tipo B e F sono non proteolitici, ma hanno caratteristiche del metabolismo dei carboidrati che differiscono dai gruppi non proteolitici tipi C e D. I ceppi di tipo G non sono stati studiati in dettaglio sufficiente per una caratterizzazione efficace e soddisfacente.

La temperatura ottimale per la crescita e la produzione di tossine è di circa 35ºC per i ceppi proteolitici; per i ceppi non proteolitici è 26-28ºC. I ceppi non proteolitici di tipo B, E e F possono produrre tossine a temperature di refrigerazione (3-4ºC). Le tossine dei ceppi non proteolitici non mostrano la massima tossicità fino all’attivazione della tossina con la tripsina. Le tossine dei ceppi proteolitici sono generalmente prodotte nella sua forma attivata.

Forme cliniche di botulismo

Ci sono quattro forme cliniche di botulismo umano:

• Intossicazione alimentare (botulismo di origine alimentare), dovuta all’ingestione di cibo contaminato da Clostridium botulinum in cui si forma la tossina.

• Botulismo delle ferite, prodotto dall’infezione di una ferita con Clostridium botulinum e dallo sviluppo della tossina in vivo dopo la crescita dei batteri nella ferita.

• Botulismo infantile, prodotto dalla produzione di tossina nel tratto digestivo di bambini piccoli colonizzati da Clostridium botulinum (la causa più comune è dovuta all’ingestione di miele o sciroppo di mais contaminati), seguita dall’assorbimento della tossina. Questi pazienti possono avere anticorpi contro la tossina.

• Botulismo intestinale degli adulti, causato dalla colonizzazione digestiva da Clostridium botulinum negli anziani, seguita da assorbimento della tossina. Questi pazienti possono avere anticorpi alla tossina.

In una qualsiasi delle forme cliniche di botulismo umano, e uguale nel botulismo animale, la tossina penetra nel sangue dal tratto gastrointestinale quando ingerito preformato con un cibo, o quando prodotto dal batterio che colonizza il tratto digestivo (bambini piccoli o adulti), o in casi eccezionali bambini da una ferita infetta con i batteri. Ci sono alcuni alimenti che hanno più probabilità di altri di contenere la tossina botulinica. Gli alimenti con un pH inferiore a 4,5 sono più difficili da essere causa di botulismo poiché a questo pH il C. botulinum non è in grado di moltiplicarsi e produrre tossina (è il caso dei succhi di frutta, degli alimenti marinati con aceto, ecc.) Al contrario, gli alimenti con pH uguale o superiore a 4,5 possono causare il botulismo, poiché in essi è possibile la moltiplicazione e la produzione di tossina (è il caso di carne, pesce, verdure, piatti pronti, ecc.), su tutti quegli alimenti privi di esposizione all’ossigeno, come nel caso degli alimenti in scatola o sottovuoto, e con un pH superiore a 4,6. Esempi di alimenti pericolosi: prosciutto stagionato, affumicato, pesce o verdura in scatola (sottoposti a trattamento termico insufficiente per uccidere le spore), ecc. Le lattine contaminate da C. botulinum sono di solito curve, anche se questo non si verifica con il tipo E.

La tossina assorbita si lega irreversibilmente alle giunzioni neuromuscolari dei motoneuroni, impedendo il rilascio di acetilcolina e causando paralisi flaccida o debolezza muscolare.

Clinicamente è caratterizzata da una paralisi flaccida acuta, che di solito inizia con un coinvolgimento bilaterale dei nervi cranici, colpendo i muscoli del viso, della testa e della faringe, e poi scende simmetricamente a colpire i muscoli del torace e gli arti. La morte, quando si verifica, è dovuta all’insufficienza respiratoria per paralisi della lingua e dei muscoli faringei che occludono le vie aeree superiori, o per paralisi del diaframma e dei muscoli intercostali. Per questo motivo, i pazienti devono ricevere l’antitossina botulinica e la terapia intensiva respiratoria necessaria.

Test diagnostici per il botulismo

Rilevamento della tossina botulinica in campioni o alimenti senza coltura (vedi campione consigliato nella sezione test “Test offerto da IVAMI e campioni richiesti”).

Questo è raccomandato in un paziente con evidenza clinica di botulismo.

Il rilevamento della tossina botulinica può essere eseguito in un liquido come il siero ottenuto dal sangue. Può anche essere rilevata dai resti di cibo mangiato che ha causato un caso o un focolaio di botulismo. Per eseguire il test utilizzando resti di cibo è necessario ottenere un estratto filtrato da esso. Nei casi di botulismo infantile o botulismo intestinale può essere rilevata la presenza di tossina nelle feci di bambini o pazienti, ma considerare più consigliabile eseguire una cultura preliminare delle feci (vedi sotto). La rilevazione della tossina del botulismo in uno qualsiasi dei casi viene eseguita mediante inoculazione in topi che sviluppano sintomi paralitici, seguiti da morte, se inoculati con tossina botulinica. Per confermare che i topi sono morti a causa della tossina botulinica inoculata, è necessario un test di neutralizzazione, che conferma che la tossina botulinica era presente e identifica il tipo di tossina botulinica presente. Questo test di neutralizzazione viene eseguito affrontando il prodotto inoculato (siero di persona o animale, estratto dal cibo ingerito, …) con antisieri specifici di ogni tipo di tossina.

Prima della fase del test di neutralizzazione è necessario calcolare la dose minima letale (MLD). Così si calcola la diluizione massima (più alta) che provoca la morte degli animali infetti, e il volume inoculato ha causato la morte degli animali contengono una dose minima letale (LMD).

Per identificare il tipo di tossina, una volta noto il “Minimum Letal dose”, questo è affrontato con diversi antisieri anti-tossina botulinum tipo. Queste miscele saranno inoculate in volume uguale a topi sperimentali e quelli che sopravvivono, sono stati inoculati con la miscela di “dose minima letale” più antisiero a un tipo che è stato in grado di neutralizzare.

Rilevazione della tossina in campioni / prodotti dopo la precultura (vedi campione consigliato dopo nel test offerto da IVAMI e campioni richiesti).

Quando il batterio Clostridium botulinum, che produce la tossina, può essere trovato nel campione si raccomanda prima coltivazione, per indagare la tossina dopo aver coltivato il campione. Questo è il caso di feci di un paziente con botulismo infantile o botulismo intestinale, i resti di cibo mangiato in cui aveva proliferato i batteri (e.gr., lattina conserva), un cibo sospetto che potrebbe contenere il batterio (e.gr., una conserva rigonfia), un cibo sotto controllo per escludere la presenza di questo batterio (e.gr, salsicce, prosciutti, lattine), o altri campioni come fanghi d’acqua dolce o sedimenti marini acquatici, ecc, da aree in cui è stata osservata la mortalità negli uccelli acquatici.

Durante la cultura in laboratorio, in mezzi di coltura adatti, la tossina viene prodotta se c’è un batterio e ottenere un filtrato di cultura può essere utile per indagare la sua presenza, inoculando il filtrato ai topi. Se i topi inoculati sono colpiti indicano la probabile presenza di Clostridium botulinum nel campione o la crescita in coltura. Tuttavia, i topi possono essere morti per un’altra causa, quindi necessario, prima di emettere il rapporto, deve essere verificare che essi sono davvero morti per essere stato inoculato con la tossina botulinica.

Per confermare la presenza di tossina botulinica nella cultura test di neutralizzazione utilizzando antisieri specifici per ogni tipo di tossina botulinica (test di neutralizzazione) può essere eseguita, o la rilevazione per la presenza di Clostridium botulinum geni e il suo tipo nel terreno di coltura (rilevamento molecolare mediante PCR).

Il test di neutralizzazione viene eseguito sottoponendo il campione inoculato (filtrato di coltura) ad antisieri specifici per ogni tipo di tossina.

Prima della fase del test di neutralizzazione è necessario calcolare la dose minima letale (MLD). Così la diluizione massima (più alta) che causa la morte degli animali inoculati è calcolata, e il volume inoculato ha causato la morte degli animali contengono una dose letale minima.

Per identificare il tipo di tossina, una volta conosciuta la “dose letale minima”, confronto la dose letale minima con diversi tipi di sieri anti-botulino viene eseguita. Queste miscele saranno inoculate in volume uguale a topi sperimentali e quelli che sopravvivono, sono stati inoculati con la miscela di “dose minima letale” più antisiero a un tipo che è stato in grado di neutralizzare.

La rilevazione molecolare da PCR evita il tempo necessario per il calcolo della dose minima letale (MLD) e test di neutralizzazione.

Rilevazione degli anticorpi anti tossina botulinica (vedi campione consigliato dopo nella sezione Test offerti da IVAMI e campioni richiesti)

• I pazienti trattati con tossina botulinica diluita, come quelli che ricevono botox per trattamenti estetici o medici (es. gr. dolore dovuto alla nevralgia del trigemino facciale), per rilevare la presenza di anticorpi che impediscono la sua azione.

• Pazienti con sospetto botulismo infantile o botulismo adulto che non è stato in grado di trovare il batterio Clostridium botulinum toxin nelle feci o siero.

• I soggetti vaccinati che sono interessati a verificare lo stato di protezione.

La tossina del Clostridium botulinum, a diluizioni molto elevate, è stata utilizzata per somministrazione locale per trattare processi spastici. Questi processi hanno dimostrato di essere un rimedio utile. Questi processi sono di solito spastici cronici e richiedono che la tossina sia somministrata in modo permanente. Pertanto, la resistenza può sorgere durante il trattamento a causa della progressiva immunizzazione del paziente durante tutto il trattamento, nel qual caso l’effetto sarebbe limitato. Per rilevare questa immunizzazione è necessario misurare con precisione e sensibilità l’esistenza di anticorpi contro la tossina botulinica A e/o B.

Il metodo di riferimento accettato per rilevare e quantificare gli anticorpi alla tossina botulinica è il test di neutralizzazione nei topi (Mouse Neutralization Assay), in cui una diluizione di tossina botulinica, quantificata dalla Dose Letale 50% per topo (DL50), mescolata con varie diluizioni di base 2 o base 4 del siero/plasma, e dopo l’incubazione ciascuna viene inoculata intraperitonealmente a gruppi di topi. La diluizione più alta del siero di prova che riduce la tossicità corrisponde al titolo anticorpale contro la tossina botulinica corrispondente. Questa diluizione, rispetto a uno standard internazionale permette di ottenere risultati in unità internazionali (UI/mL) (1 UI è definita come la quantità di anticorpo che neutralizza 10.000 LD50 di tossine A o B, o 1000 LD50 tipo E). La quantità di tossina usata nei test è quella che viene neutralizzata da 0,02; 0,005 e 0,0125 IU/mL di antitossina per i tipi A, B ed E, rispettivamente (Hatheway et al. 1984). I sieri che proteggono i topi titolo di 1: 4 sono riportati come <0,08 UI / mL per il tipo A, o <0,02 UI / mL per il tipo B. Il test è laborioso, costoso e lunga durata esecuzione, così le alternative sono state cercate enmzimoinmunoanálisis metodi basati (ELISA) utilizzando micropiastre rivestite con tossina botulinica. Tuttavia, i valori ottenuti da ELISA a volte non pienamente correlati con test di neutralizzazione nei topi.

Prima della fase di test di neutralizzazione è necessario calcolare la dose minima letale (DLM) di tossina. Il calcolo della dose minima letale viene eseguito con diluizioni in base 10 del filtrato di coltura, diluendo la metà con soluzione fisiologica per ottenere la stessa diluizione della tossina mescolata con il siero o il plasma del paziente, e inoculando ogni miscela di diluizione nei topi da laboratorio. Così si calcola la diluizione massima (più alta) che causa la morte degli animali infetti. Il volume inoculato ha causato la morte degli animali contiene una dose minima letale (MLD).

Una volta nota la dose minima letale, calcolare la dose minima non letale (dmnm) corrispondente alla quantità minima di tossina in presenza di una quantità costante di antitossina, che non uccide i topi inoculati. Questa quantità di tossina viene neutralizzata dalle unità corrispondenti di anti-tossina A o antitossina B. La dose minima non letale è chiamata perché è la quantità minima di tossina che non causa la morte dei topi in presenza di antitossina.

Test offerti da IVAMI e campioni richiesti:

• Rilevazione della tossina botulinica in casi umani o focolai di botulismo alimentare:

• • Siero del paziente (almeno 5 mL) ottenuto più recentemente per inoculazione nei topi e tipizzazione della tossina, se i topi sono stati colpiti.

• • Nei casi di botulismo infantile o botulismo intestinale, la tossina botulinica può essere rilevata nelle feci dei bambini/pazienti, ma si consiglia maggiormente di eseguire una coltura preliminare delle feci.

• Rilevazione della tossina e/o del Clostridium botulinum negli alimenti ingeriti, sospettati di provocare il botulismo, o negli alimenti soggetti a controllo

• • Campione dell’alimento sospetto o controllato (si consiglia almeno circa 100 grammi) per preparare un campione destinato all’inoculazione dei topi e rilevare la presenza della tossina preformata negli alimenti, così come per eseguire una coltura per ottenere il filtrato per inoculare i topi e determinare se c’era un batterio produttore di tossina nel campione; Se si hanno solo resti di cibo, si raccomanda di inviare l’intera quantità disponibile.

• Rilevamento del Clostridium botulinum in casi di botulismo infantile o botulismo intestinale

• • Feci in casi di botulismo infantile o botulismo intestinale dovuto a colonizzazione intestinale (10 g), per la coltura e il rilevamento della tossina nel filtrato di coltura mediante inoculazione di topi.

• Rilevamento del Clostridium botulinum in casi di botulismo nelle ferite

• • Esudato di ferita in casi di sospetto botulismo nelle ferite, per la coltura e il rilevamento della tossina nel filtrato di coltura tramite inoculazione nei topi. Se il campione è trasportato aerobicamente, il Clostridium botulinum potrebbe essere stato inattivato, sarebbe più conveniente eseguire un test molecolare per la presenza di geni del Clostridium botulinum e, se positivo, identificare il tipo di tossina botulinica rilevando i geni corrispondenti ad ogni tipo di tossina.

• Rilevamento del Clostridium botulinum in campioni di fanghi di acqua dolce o sedimenti marini acquatici, e altri prodotti non inclusi nelle sezioni precedenti

• • 100 g di campioni circa per eseguire una coltura per la crescita del Clostridium botulinum e ottenere un filtrato di coltura per inoculare i topi.

• Rilevazione degli anticorpi anti tossina botulinica nel siero o nel plasma

• • Siero o plasma (circa 10 mL), per testare gli anticorpi di neutralizzazione nel siero o plasma contro diverse tossine disponibili in laboratorio. Questo test è di interesse per determinare la presenza di anticorpi specifici in persone trattate con tossina botulinica, in pazienti con sospetto botulismo infantile, in adulti che non è stato in grado di trovare il batterio nelle feci, o in individui vaccinati per verificare lo stato di protezione. Nei casi di persone trattate con tossina botulinica deve indicare il tipo di tossina somministrata al paziente.

Tempo per la comunicazione dei risultati (TAT)

• Non possiamo dare tempi esatti. Se il test è solo per l’individuazione della tossina tramite inoculazione nei topi e il risultato è negativo, il rapporto dei risultati sarebbe un massimo di una settimana. Se i test includono la coltivazione del campione, e poi rilevare la tossina fatta inoculando un filtrato di cultura dei topi, il tempo sarebbe di due settimane. Se uno qualsiasi di questi test inoculazione del mouse, estratto da un campione o filtrata di cultura, sono stati positivi, test di neutralizzazione deve essere eseguita nei topi per confermare che è tossina botulinica e identificare il suo tipo da test di neutralizzazione, il tempo di completamento è 15 giorni.

• Test PCR tempo reale il rapporto sono in 3 o 4 giorni.

Formulario con caratteristiche del prodotto e test scelti

• Se la domanda di condurre test con il prodotto deve presentare una lettera in cui le caratteristiche del prodotto e i test scelti da eseguire con il campione inviato.

Volume del campione

• Vedi in ogni caso, a seconda del tipo di prove offerte da IVAMI.

Condizioni di conservazione e spedizione di campioni

• Sono inviati sulle condizioni in cui il campione è solitamente trovato, protetto per il trasporto. Nel caso di campioni che possono decomporsi perché contaminati da batteri, o dal proprio organico (deperibili, sieri di animali o umani, feci, fanghi, … …), i campioni devono essere conservati e spediti congelati, o almeno nelle condizioni che garantiscono il raffreddamento durante il trasporto (con il contenitore del campione all’interno di una scatola -polistirolo espanso- (sughero bianco) con impacchi freddi congelati. Nota: questo organismo da solo non rappresenta un rischio di contaminazione per esposizione biologica.

Costo dei test

• Rilevazione della tossina in casi umani / focolai di botulismo alimentare

• • Inoculazione nei topi con siero del paziente o estratto dal cibo ingerito ………………………………. ……………………………………………………………………………………………………………Consulto [email protected]

• • Se è positivo, test di conferma per la neutralizzazione e l’identificazione del tipo di tossina …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consultare [email protected] .

• Rilevamento della tossina e/o del Clostridium botulinum negli alimenti ingeriti, sospettati di causare il botulismo, o negli alimenti soggetti a controllo

• Rilevamento del Clostridium botulinum nei casi di botulismo infantile o intestinale

• • Optional: Test di inoculazione nei topi con siero o estratto dal cibo ingerito ………………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………Consulta [email protected]
  • Raccomandato. Test di coltura, seguito da inoculazione di topi con filtrato di coltura ………………………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consultare [email protected]
  • Se è positivo, test di conferma per neutralizzazione e identificazione del tipo di tossina ……………………. …………………………………………………………………………………………………………..Consultare [email protected]

• Rilevamento del Clostridium botulinum nei casi di botulismo da ferita

• • Test di coltura, seguito dall’inoculazione nei topi del filtrato di coltura ……………………. Consultare [email protected]
  • Se è positivo, test di conferma per neutralizzazione e identificazione del tipo di tossina …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consultare [email protected]

• Rilevamento del Clostridium botulinum in campioni di fanghi/acqua dolce o sedimenti marini, e altri prodotti non inclusi nelle sezioni precedenti

• • Test di coltura, seguito da inoculazione di topi con filtrato di coltura ……………………. Consultare [email protected]
  • Se è positivo, test di conferma per la neutralizzazione e l’identificazione del tipo di tossina ………………. …………………………………………………………………………………………………………..Consultare [email protected]

• Rilevazione di anti-tossina botulinica nel siero o nel plasma (si riferisce a un tipo di anticorpo, quindi deve indicare il tipo di tossina somministrata all’individuo) ……………………………………………….. Consult [email protected]