Carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) e la sua gestione

Il cancro è una malattia pericolosa per la vita che causa circa 8 milioni di morti ogni anno in tutto il mondo. Il cancro dell’esofago è al sesto posto nella lista delle cause più comuni di morte per cancro, contribuendo a circa mezzo milione di morti ogni anno (GLOBOCAN 2012). Tra i diversi sottotipi di cancro esofageo, l’ESCC è il tipo istologico predominante ed è altamente prevalente nelle aree meno sviluppate, specialmente in alcune regioni dell’Asia e dell’Africa. Ai pazienti ESCC viene offerto un trattamento multimodale. I pazienti in stadio precoce con tumori resecabili sono trattati con resezione tumorale anticipata, mentre i pazienti in stadio avanzato sono trattati prima con chemioterapia/chemoradioterapia per il downstaging del tumore prima della resezione chirurgica. Anche se questo trattamento neoadiuvante pre-chirurgico può ottenere una risposta eccellente in sottogruppi di pazienti che sono sensibili alla chemioterapia/chemoradiazione, circa un terzo dei pazienti mostra ancora solo una risposta parziale e subottimale. Anche per i pazienti che rispondono alla chemioterapia/chemoradiazione, alcuni di loro possono sviluppare resistenza nel corso successivo del periodo di trattamento. Per quei pazienti i cui tumori non sono resecabili, e quando il tumore è refrattario alla chemioterapia o alla radioterapia, non è disponibile alcun trattamento efficace. Per fornire più opzioni di trattamento per i pazienti non emendabili dalle terapie attuali, nuovi approcci di trattamento sono proposti e valutati in studi clinici in corso per la loro efficacia antitumorale. Anche con tutte queste modalità di trattamento in evoluzione e appena emerse, la cura completa della malattia è ancora difficile. Alla luce di ciò, nuovi trattamenti sono urgentemente necessari.

L’uso di modelli animali xenograft per la ricerca preclinica

Lo scopo principale dello sviluppo di modelli animali xenograft per la ricerca è quello di collegare la ricerca di base e clinica e di integrare l’uso di sistemi di modelli in vitro. I modelli animali di xenotrapianto tumorale forniscono una piattaforma più sofisticata per studiare il processo di tumorigenesi in un ambiente in vivo. Questa piattaforma ci permette di avere una migliore comprensione del coinvolgimento di alcuni oncogeni o soppressori tumorali nello sviluppo del tumore, scoprendo le loro relative vie di segnalazione e meccanismi di malattia. Inoltre, l’uso di questi modelli può fornirci uno strumento di ricerca per la valutazione preclinica della risposta ai farmaci, determinando l’efficacia antitumorale oltre alla tossicità dei farmaci, la farmacocinetica e la farmacodinamica. Oltre alla valutazione della risposta ai farmaci, questi modelli possono anche facilitare la ricerca di imaging biomedico, fornendo un sistema modello per testare l’utilità e la praticità su nuovi metodi di rilevamento del tumore o reagenti.

I topi sono gli animali più comunemente utilizzati per i modelli di xenotrapianto del tumore a causa di diverse caratteristiche chiave vantaggiose, come la presenza di dimensioni del genoma paragonabili a quelle degli esseri umani, breve ciclo riproduttivo, grandi dimensioni della cucciolata, basso costo di manutenzione e facilità di manipolazione. Diversi ceppi di topi con background di immunodeficienza unici sono utilizzati nella ricerca sul cancro, e questi includono topi nudi atimici, topi SCID e topi NOD/SCID (topi SCID con un livello extra di immunodeficienza). Tra questi ceppi, i topi NOD/SCID dimostrano la migliore immunodeficienza a causa dell’assenza o del difetto di quasi tutti i tipi di cellule immunitarie (cellule B, cellule T, cellule dendritiche, macrofagi e cellule natural killer), seguiti da topi SCID privi di cellule B e cellule T e poi topi nudi atimici senza cellule T. A causa dei loro vari livelli di immunodeficienza, diversi ceppi sono considerati per l’uso per diversi scopi di ricerca. Tenendo conto del costo e delle caratteristiche dei diversi ceppi, i topi atimici nudi e SCID sono preferibilmente utilizzati per l’impianto di linee cellulari tumorali umane, mentre i topi SCID e NOD/SCID sono piuttosto utilizzati per il trapianto di tumori umani.

Modelli animali xenografici tumorali comunemente usati per la ricerca ESCC

Tre tipi di modelli animali xenografici tumorali per la ricerca ESCC sono sviluppati impiantando cellule/xenograft ESCC o tumori di pazienti in animali immunodeficienti, cioè modello xenografico sottocutaneo, ortotopico e derivato dal paziente (Fig. 1). Ognuno di essi ha i propri punti di forza e di debolezza in termini di caratteristiche del modello (Tabella 1), metodi di creazione (Tabella 2) e utilità precliniche (Tabella 3), che li collocano in una posizione unica per la ricerca in fase iniziale, media o avanzata.

Modello di xenotrapianto tumorale sottocutaneo

Il modello di xenotrapianto tumorale sottocutaneo è un modello animale classico per la ricerca ESCC. Questo modello è stabilito impiantando cellule/xenotrapianti ESCC sotto la pelle di animali immunodeficienti per sviluppare tumori sottocutanei. La procedura per stabilire il tumore sottocutaneo è tecnicamente semplice, in quanto comporta solo l’iniezione con ago di cellule ESCC o l’impianto diretto di xenotrapianti ESCC sotto la pelle degli animali. La crescita dei tumori sottocutanei può essere eseguita in modo non invasivo utilizzando un calibro elettronico per misurare i tumori palpabili. Queste procedure tecniche di creazione e monitoraggio del tumore possono mantenere la riproducibilità e l’efficacia (sia in termini di tempo che di costi) di questo modello. Nonostante questi vantaggi, questo modello soffre di alcune limitazioni poiché non rappresenta completamente la situazione clinica. Per esempio, questo modello associa una ridotta eterogeneità del tumore poiché nella maggior parte degli scenari vengono utilizzate linee cellulari ESCC omogenee come materiale di partenza. Inoltre, i tumori sottocutanei non crescono nel loro microambiente tumorale nativo e questo li rende non adatti per lo studio delle interazioni tumore-stromale. Con tali punti di forza e di debolezza, questo modello è utilizzato principalmente nella ricerca in fase iniziale per studiare la biologia e il meccanismo della tumorigenesi ESCC.

I rapporti accumulati hanno rivelato il vantaggio di applicare il modello di xenotrapianto del tumore sottocutaneo per la ricerca in fase iniziale, utilizzandolo per studiare le proprietà tumorali delle molecole legate all’ESCC e i loro meccanismi di malattia associati. La sovraespressione del microRNA-340, un microRNA downregolato nei tumori ESCC, nelle cellule ESCC EC9706 ha inibito le proprietà di crescita di queste cellule in un modello di xenotrapianto tumorale sottocutaneo. L’effetto di questo microRNA su ESCC era mediato in parte attraverso il suo effetto su una proteina transferasi PSAT1, che è stata identificata nello stesso studio come un bersaglio diretto del microRNA-340. Un altro studio ha dimostrato una crescita più rapida dei tumori sottocutanei derivati da cellule ESCC KYSE-30 con sovraespressione di una metalloproteinasi di matrice MMP1 rispetto alle cellule di controllo. Inoltre, queste cellule ESCC sovraespresse con MMP1 presentavano anche un potenziale metastatico. La capacità di MMP1 di promuovere la progressione tumorale e le metastasi è stata concordemente rivelata essere dovuta al suo effetto stimolante su una via tumorale che coinvolge PI3K e AKT. Un rapporto separato ha anche utilizzato un modello di xenotrapianto di tumore sottocutaneo per rivelare la proteina 2 (CRABP2) che lega l’acido retinoico cellulare come un soppressore tumorale, mostrando un tasso di crescita più lento dei tumori sottocutanei derivati da cellule EC109 ESCC che sovraesprimono CRABP2 rispetto al gruppo sperimentale di controllo. Questi studi indicano collettivamente l’utilità di questo modello per studiare le molecole legate all’ESCC e i loro meccanismi correlati nell’ESCC.

Oltre all’uso del modello di xenotrapianto del tumore sottocutaneo per lo studio della biologia del tumore, sono stati fatti tentativi per usare questo modello per studiare l’efficacia antitumorale di nuovi metodi di trattamento o composti/farmaci per trattare l’ESCC. Topi portatori di tumore sottocutaneo sono stati sottoposti a trattamento per indurre l’espressione di un marcatore prognostico ESCC microRNA-375 e alla fine dell’esperimento sono state ottenute dimensioni tumorali inferiori rispetto all’esperimento di controllo. Oltre all’uso di routine per esaminare nuovi metodi di trattamento, questo modello è stato anche applicato per studiare l’efficacia antitumorale di nuovi composti/farmaci per contrastare l’ESCC, come il temsirolimus attualmente utilizzato per i pazienti con carcinoma a cellule renali. Oltre alla sua utilità nei test di antitumorigenicità, questo modello può essere applicato per esaminare gli effetti chemio-sensibilizzanti dei composti di prova. Il trattamento di animali portatori di tumore sottocutaneo con Ginsenoside Rg3, un ingrediente estratto dal ginseng, ha fornito prove che dimostrano gli effetti sensibilizzanti di questo composto a due farmaci chemioterapici paclitaxel e cisplatino comunemente utilizzati per i pazienti ESCC. Più recentemente, un nuovo trasportatore di ossigeno YQ23 ha dimostrato di esercitare effetti chemio-sensibilizzanti selettivamente su xenotrapianti di ESCC SLMT-1 sottocutanei resistenti alla chemio, ma non su xenotrapianti di ESCC HKESC-2 sensibili alla chemio, in piani di trattamento che utilizzano cisplatino o 5-fluorouracile, che sono anche farmaci chemioterapici tradizionali utilizzati per i pazienti ESCC. Gli studi di cui sopra che esaminano l’efficacia antitumorale dei composti/farmaci di prova da soli o in combinazione con i comuni farmaci chemioterapici utilizzati per ESCC hanno evidenziato l’utilità preclinica del modello di xenotrapianto tumorale sottocutaneo per la sperimentazione di composti/farmaci.

Insieme, i modelli di xenotrapianto tumorale sottocutaneo, in particolare quelli ben caratterizzati per la loro sensibilità ai chemioterapici attualmente utilizzati per l’ESCC, sono strumenti di ricerca preziosi per studiare la biologia del tumore e i meccanismi della malattia dell’ESCC in un ambiente in vivo e per eseguire studi preclinici di efficacia antitumorale (Tabella 3).

Modello di xenotrapianto tumorale ortotopico

Il modello di xenotrapianto tumorale ortotopico è un modello alternativo di cancro animale utilizzato per la ricerca ESCC. Questo modello è stabilito impiantando cellule/xenotrapianti ESCC nell’esofago di animali immunodeficienti per sviluppare tumori ortotopici. La procedura per stabilire i tumori ortotopici è tecnicamente più impegnativa rispetto a quella necessaria per stabilire i tumori sottocutanei, in quanto richiede la chirurgia e/o l’anestesia dei piccoli animali. Due approcci principali sono impiegati per impiantare cellule ESCC/xenografts nell’esofago animale, per i quali differiscono nel sito di impianto del tumore. Un metodo impianta cellule ESCC/xenotrapianti nella regione superiore dell’esofago, mentre l’altro impianta cellule ESCC/xenotrapianti nell’estremità inferiore dell’esofago nella regione addominale vicino alla giunzione gastroesofagea. Recentemente, abbiamo anche riportato il confronto di sopravvivenza tra gli animali con tumore ortotopico sviluppato nella regione esofagea superiore e la regione inferiore, e trovato che quelli con tumore nella regione addominale hanno una migliore sopravvivenza. Anche se è più tempo e lavoro intensivo per stabilire tumori ortotopici, questo modello può ospitare lo studio della crescita del tumore in un microambiente tumorale corretto come nella situazione clinica e consentire lo studio delle interazioni tumore-stromale. Tuttavia, soffre anche della stessa limitazione del modello sottocutaneo utilizzando linee cellulari ESCC come materiale di partenza per la creazione del tumore. Un altro grande svantaggio di questo modello è la necessità di utilizzare metodi di imaging specializzati, ad esempio il sistema di imaging in vivo accoppiato con l’uso della tecnologia bioluminescente, per monitorare la crescita del tumore. Nonostante queste limitazioni, i punti di forza di questo modello lo rendono un modello animale prezioso per l’uso nella ricerca di fase media e tardiva.

Anche se il modello di xenotrapianto tumorale ortotopico offre vantaggi superiori rispetto al modello sottocutaneo, il suo uso rimane limitato a causa delle limitazioni di cui sopra. Nonostante queste carenze, un numero crescente di rapporti ha esemplificato l’applicazione di questo modello per studiare la tumorigenesi di ESCC e per eseguire test preclinici di antitumorigenicità. Quando questo modello è stato utilizzato per rivelare l’effetto di soppressione del tumore di una proteasi transmembrana DESC1, è stato osservato un tasso di crescita tumorale più lento con l’uso di cellule ESCC KYSE-150 che esprimono DESC1 rispetto a quelle che utilizzano cellule di controllo. In uno studio indipendente utilizzando questo modello per esaminare il fenotipo tumorale di una proteina chinasi AKT correlata al tumore, è stato trovato un evidente effetto di soppressione del tumore associato al knockdown di AKT, in modo tale che un tasso di crescita ridotto di tumori ortotopici è stato prontamente rilevato. A parte il suo uso per studiare la crescita del tumore, questo modello può essere applicato per studiare il meccanismo di invasione del tumore. Uno studio completo ha evidenziato il coinvolgimento di una molecola di superficie cellulare CD44H sull’invasione tumorale sulla base dei modelli invasivi osservati tra i tumori ortotopici derivati da cellule T.T ESCC e la controparte invasiva T.T-1 ESCC. La linea cellulare T.T-1 ESCC ha espresso un alto livello di CD44H ed è stata derivata da cellule tumorali isolate dal linfonodo cervicale in un modello di xenotrapianto tumorale ortotopico derivato da cellule T.T ESCC. Oltre al suo uso per studiare la crescita e l’invasione del tumore, questo modello è in grado di valutare gli effetti dei composti di prova sulle sopravvivenze post-trattamento. Una sopravvivenza prolungata è stata osservata in animali portatori di tumore ESCC ortotopico dopo il trattamento con un inibitore mTOR temsirolimus, per il quale questo inibitore è attualmente utilizzato per il carcinoma a cellule renali.

Generalmente, modello xenotrapianto tumore ortotopico integra l’uso regolare di modello sottocutaneo per lo studio di ESCC, fornendo un microambiente tumorale corretto. Inoltre, questo modello funziona come uno strumento indispensabile nella ricerca preclinica per esaminare gli effetti antitumorali dei composti/farmaci di prova (Tabella 3).

Modello xenotrapianto tumorale derivato dal paziente

Il modello xenotrapianto tumorale derivato dal paziente è un modello di cancro animale più avanzato dei modelli sopra menzionati per la ricerca ESCC. Questo modello è stabilito con l’uso di tumori ESCC resecati da pazienti per sviluppare xenotrapianti tumorali in animali immunodeficienti. I tumori dei pazienti possono essere impiantati per via sottocutanea o ortotopica. A seconda del sito di impianto del tumore, questo modello mantiene anche alcune caratteristiche come i modelli di xenotrapianto tumorale sottocutaneo e ortotopico. È notevole che gli xenotrapianti tumorali derivati dai tumori dei pazienti abbiano conservato le proprietà genetiche, istologiche e fenotipiche dei tumori del donatore. Poiché i componenti stromali e cellulari degli xenotrapianti tumorali derivati dal paziente sono mantenuti come nei tumori del donatore, l’uso di questo modello può escludere gli svantaggi associati all’uso di linee cellulari tumorali omogenee. Nonostante questi vantaggi, questo modello soffre inevitabilmente di diverse limitazioni. La creazione del modello richiede l’uso di tumori di pazienti resecati, per i quali alcuni laboratori di ricerca di base potrebbero non avere accesso a questa fonte di campioni. Inoltre, i tassi di incisione dei tumori dei pazienti per formare xenotrapianti tumorali sono subottimali e variano a seconda di una serie di fattori, come i tipi di tumore, siti di impianto del tumore, ceppi di topi, caratteristiche del tumore e caratteristiche del paziente. Anche per un tumore del paziente che può essere inciso con successo, è necessario un lungo periodo di latenza per crescere in uno xenotrapianto tumorale e talvolta questo processo può durare fino a 6 mesi. Pertanto, le limitazioni di cui sopra hanno reso il processo di costituzione del tumore una procedura ad alto costo e ad alta intensità di lavoro. Nonostante questi aspetti negativi, questo modello sta gradualmente sostituendo altri modelli di cancro animale da utilizzare nella ricerca di medio e ultimo stadio ed è particolarmente utile per la valutazione preclinica dell’efficacia antitumorale di nuovi composti/farmaci. Infatti, questo modello è a volte indicato come “prove cliniche in un topo” a causa del suo potere superiore di prevedere la risposta clinica di composti/farmaci di prova a causa dell’alta somiglianza tra xenotrapianti tumorali e tumori del donatore.

Considerando tutti i pro e i contro, il modello di xenotrapianto tumorale derivato dal paziente può fornirci una piattaforma di ricerca non solo per studiare i meccanismi della malattia di ESCC ma può anche facilitare lo screening preclinico dei farmaci. Per quest’ultima applicazione, questo modello è usato più preferibilmente rispetto ai modelli sottocutanei e ortotopici a causa della sua alta rilevanza clinica, che supporta il suo uso nella valutazione dell’efficacia antitumorale di nuovi composti/farmaci. In quest’area, singoli gruppi di ricerca hanno stabilito le loro collezioni di modelli xenografici di tumori derivati da pazienti con eterogeneità tumorale preservata per lo screening di farmaci o combinazioni di farmaci per l’ESCC (Tabella 4).

I modelli di xenotrapianti tumorali derivati da pazienti con deregolazioni molecolari ben caratterizzate che si trovano comunemente in ESCC possono essere utilizzati come strumento per testare i farmaci attualmente utilizzati per i loro nuovi usi su ESCC. Questo processo è importante perché può ricercare nuovi farmaci per i pazienti che sono resistenti ai trattamenti farmacologici attuali. Il cisplatino e il 5-fluorouracile sono due farmaci chemioterapici usati per l’ESCC, ma non tutti i pazienti hanno una buona risposta al farmaco. Per avere una migliore comprensione del meccanismo del farmaco, Zhang et al. hanno stabilito un pannello di modelli di xenotrapianti tumorali derivati da pazienti e li hanno ben caratterizzati per le comuni aberrazioni genetiche frequentemente rilevate nell’ESCC, come l’espressione di HER2 e le mutazioni di EGFR (recettore del fattore di crescita epidermico), K-ras, B-raf e PIK3CA (fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato 3-kinase subunità catalitica alfa). Utilizzando un pannello di xenotrapianti con stato HER2 e PIK3CA ben caratterizzato per esaminare l’effetto del trattamento di cisplatino e 5-fluorouracile, gli xenotrapianti tumorali negativi per HER2 e portatori di PIK3CA wild-type sono stati più sensibili a tale trattamento rispetto agli xenotrapianti HER2-positivi indipendentemente dallo stato della mutazione di PIK3CA. I risultati derivati da questo studio hanno rivelato il legame tra le composizioni genetiche del tumore e le risposte ai farmaci chemioterapici.

Oltre all’uso di modelli xenotrapianti di tumori derivati da pazienti con composizioni genetiche definite per testare i farmaci chemioterapici convenzionali, questi modelli sono stati utilizzati per esaminare l’efficacia antitumorale di farmaci che non sono usati clinicamente per ESCC, come trastuzumab e lapatinib. Testando l’effetto del trastuzumab sugli xenotrapianti tumorali derivati dai pazienti, è emerso che gli ESCC HER2-positivi rispondevano a tale trattamento, ma non a quelli che portavano la concomitante mutazione PIK3CA. Un ulteriore trattamento di questi xenotrapianti tumorali HER2-positivi e PIK3CA-mutati con l’inibitore AKT AZD5363 ha successivamente reso gli xenotrapianti nuovamente reattivi al trattamento con trastuzumab. Un altro studio ha esaminato l’effetto sensibilizzante di lapatinib sui farmaci chemioterapici oxaliplatino o 5-fluorouracile utilizzando un modello di xenotrapianto tumorale derivato dal paziente. Il trattamento combinato di lapatinib con 5-fluorouracile ha portato a un effetto inibitorio della crescita più potente del lapatinib da solo o del suo trattamento combinato con oxaliplatino. Questi studi hanno presentato chiaramente l’utilità di questi modelli per i test preclinici dei farmaci. Inoltre, tali test su xenotrapianti tumorali con background genetico definito possono facilitare lo sviluppo della medicina di precisione selezionando il trattamento farmacologico basato sulle deregolazioni genetiche dei tumori.

I modelli di xenotrapianti tumorali derivati dai pazienti possono imitare la diversità genetica e la composizione delle impostazioni cliniche grazie all’elevata rilevanza istologica e patologica tra i tumori del donatore e gli xenotrapianti tumorali stabiliti. Questi studi precedenti hanno presentato l’applicazione preclinica di questi modelli per valutare l’efficacia antitumorale di diversi farmaci/composti (Tabella 3). I risultati derivati possono anche fornire prove solide a sostegno dell’uso di nuovi farmaci/composti per il trattamento dell’ESCC. Tale test preclinico forma quindi una piattaforma vitale prima degli studi clinici.