Implicazione clinica

L’instabilità dei microsatelliti (MSI) deriva dall’accumulo sistematico di delezioni/inserzioni in brevi sequenze ripetitive di DNA nelle cellule tumorali con un sistema di riparazione del mismatch (MMR) carente. MSI si verifica in circa il 15% di tutti i tumori colorettali ed è clinicamente utile per identificare i pazienti con cancro colorettale ereditario non poliposico (HNPCC, sindrome di Lynch) causato da mutazioni germinali dei geni MMR. Lo stato MSI può anche predire la risposta/resistenza del cancro a certe chemioterapie.

Nel tentativo di standardizzare l’analisi MSI, un workshop del 1997 del National Cancer Institute (NCI) ha raccomandato un pannello di riferimento di cinque marcatori di microsatelliti per il rilevamento di MSI e ha stabilito linee guida di classificazione MSI basate sui risultati. Il pannello di riferimento, chiamato pannello Bethesda, consiste di due loci mononucleotidici (Big Adenine Tract o BAT-25 e BAT-26) e tre loci dinucleotidici (D2S123, D5S346 e D17S250). Usando il pannello Bethesda, i tumori con instabilità a 2 o più di questi loci sono stati interpretati come MSI-high (MSI-H), e i tumori senza instabilità a nessuno dei cinque loci sono stati considerati Microsatellite Stable (MSS). In un ulteriore workshop NCI di follow-up, è stato riconosciuto che la sensibilità e la specificità del pannello Bethesda originale potrebbero essere limitate a causa dell’inclusione di ripetizioni dinucleotidiche, che sono meno sensibili e specifiche delle ripetizioni mononucleotidiche per l’identificazione dei tumori con carenze MMR. E’ stato suggerito che un pannello di ripetizioni mononucleotidiche quasimonomorfiche potrebbe essere abbastanza sensibile e specifico per l’individuazione di tumori ad alto livello di MSI e potrebbe ovviare alla necessità di un DNA normale per i tumori da testare (1-8).

MSI Analysis System (kit solo per la ricerca, versione 1.2, Promega Corporation).

Il MSI Analysis System è un test multiplex, basato sulla PCR fluorescente per l’individuazione dell’instabilità dei microsatelliti. Il sistema di analisi MSI include primer marcati in modo fluorescente per la co-amplificazione di cinque marcatori ripetuti mononucleotidici quasimonomorfi (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 e MONO-27). I prodotti di PCR sono separati mediante elettroforesi capillare (CE) utilizzando un analizzatore genetico Applied Biosystems 3500Dx. L’instabilità dei microsatelliti in 2 o più loci mononucleotidici viene interpretata come MSI-alta; l’instabilità dei microsatelliti in un singolo locus mononucleotidico o nessuna instabilità in nessuno dei loci testati viene interpretata come microsatellite stabile (MSS). Tipicamente, i campioni ad alta MSI mostrano instabilità in tutti i loci con una diminuzione media della dimensione del prodotto da 5 a 9 basi. La presenza di MSI viene rilevata con una specificità analitica di almeno il 99% e un limite di rilevamento di almeno il 5%.

Un’importante caratteristica di progettazione del sistema di analisi MSI è la spaziatura tra i cinque diversi loci, che generalmente supera il numero tipico di basi spostate (in media da 5 a 9 basi) quando è presente MSI. La dimensione dell’amplicone PCR più lunga è di 154 coppie di basi, il che è vantaggioso per l’analisi di tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE).

Questo test è lo standard per i test MSI di routine ad alta produttività, specialmente quando vengono richiesti altri test molecolari a valle sullo stesso campione di DNA.

Requisiti del campione

I campioni accettabili per il test sono campioni di tessuto di carcinoma colorettale fissati in formalina e inclusi in paraffina con un tempo di fissazione di 6-48 ore.

Volume

È preferibile un blocco di paraffina rappresentativo. In alternativa, per i campioni di resezione è richiesto un minimo di 5 sezioni di tessuto non colorate (5 µm di spessore).

Istruzioni per la conservazione e la spedizione

Mantenere e spedire i campioni a temperatura ambiente.

Limitazioni

Un contenuto tumorale insufficiente potrebbe non consentire il rilevamento dell’instabilità MSI: è richiesto il 10% delle cellule tumorali. Il contenuto tumorale viene valutato prima dell’analisi e viene eseguita una macrodissezione. Fissativi diversi dalla formalina o tempi di fissazione prolungati possono dare risultati inadeguati.

Requisiti speciali

Nessuno.

Turn-around-time

Da 5 a 7 giorni lavorativi rispettivamente per vetrini e blocchi di paraffina.

2. IdyllaTM MSI Assay (CE-IVD) – Accreditamento in corso

L’IdyllaTM MSI Assay (RUO) esegue il rilevamento dell’instabilità dei microsatelliti direttamente da sezioni di tessuto tumorale umano fissate in paraffina (FFPE) utilizzando una reazione PCR seguita da un’analisi della curva di fusione ad alta risoluzione su uno strumento IdyllaTM.

Il test esegue il rilevamento di mutazioni in 7 loci omopolimerici monomorfi per l’identificazione di tumori umani con instabilità dei microsatelliti (ACVR2A, BTBD7, DIDO1, MRE11, RYR3, SEC31A e SULF2). Questi biomarcatori sono tumore-specifici, mostrano un’alta frequenza nei tumori colorettali ed endometriali e sono stabili in diverse etnie. Inoltre, questi biomarcatori tumore-specifici non richiedono l’analisi di campioni di tessuto normale appaiati.

Lo stato MSI per un campione è determinato con la chiamata finale per tutti i 7 biomarcatori. L’instabilità dei microsatelliti in 2 o più loci mononucleotidici viene interpretata come MSI-alta; l’instabilità dei microsatelliti in un singolo locus mononucleotidico o nessuna instabilità in nessuno dei loci testati viene interpretata come stabile ai microsatelliti (MSS).

Questo test permette un basso throughput di test MSI ed è ideale per test di riflesso o di salvataggio per ottenere o confermare rapidamente un risultato MSI preciso.

Requisiti del campione

I campioni accettabili per il test sono campioni di tessuto di carcinoma colorettale fissati in formalina e inclusi in paraffina con un tempo di fissazione di 6-48 ore.

Volume

È preferibile un blocco di paraffina rappresentativo. In alternativa, per i campioni di resezione è richiesto un minimo di 2 sezioni di tessuto non colorate (5 µm di spessore; 50-600mm²).

Istruzioni per la conservazione e la spedizione

Mantenere e spedire i campioni a temperatura ambiente.

Limitazioni

Un contenuto tumorale insufficiente potrebbe non consentire il rilevamento dell’instabilità MSI: è richiesto il 20% delle cellule tumorali. Il contenuto tumorale viene valutato prima dell’analisi e viene eseguita una macrodissezione. Fissativi diversi dalla formalina o tempi di fissazione prolungati possono dare risultati inadeguati.

Requisiti speciali

Nessuno.

Turn-around-time

Da tre a cinque giorni lavorativi rispettivamente per vetrini e blocchi di paraffina.

1. Umar A, Boland CR, Terdiman JP et al. Revised Bethesda Guidelines for Hereditary Nonpolyposis Colorectal cancer (Lynch Syndrome) and Microsatellite Instability. Journal of the National Cancer Institute 2004;96(4):261-268.
2. De la Chapelle A, Hampel H. Clinical Relevance of Microsatellite Instability in Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology 2010;28(20):3380-3387.
3. Bacher JW, Flanagan LA, Smalley RL et al. Development of a fluorescent multiplex assay for detection of MSI-High tumors. Disease Markers 2004; 20:237-250.
4. Murphy KM, Zhang S, Geiger T et al. Confronto tra il Microsatellite Instability Analysis System e il Bethesda Panel per la determinazione dell’instabilità dei microsatelliti nei tumori colorettali. Journal of Molecular Diagnostics 2006;8(3):305-311.
5. Anderson S, Bloom KJ, Vallera DU et al. Multisite Analytic Performance Studies of a Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of BRAF V600E Mutations in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Specimens of Malignant Melanoma. Arch pathol lab Med 2012;136(11):1385-1391.
6. Buhard O, Suraweera N, Lectard A et al. Ripetizioni mononucleotidiche quasimonomorfe per l’analisi dell’instabilità dei microsatelliti di alto livello. Disease Markers 2004;20:251-257.
7. Patil DT, Bronner MP, Portier BP et al. Un pannello di cinque marcatori in una PCR multiplex rileva accuratamente i tumori colorettali ad alta instabilità dei microsatelliti senza DNA di controllo. Diagn Mol Pathol 2012 Sep;21(3):127-33.
8. Berg KD, Glaser CL, Thompson RE et al. Rilevamento dell’instabilità dei microsatelliti mediante reazione a catena della polimerasi mulitplex a fluorescenza. J Mol Diagn 2000, 2:20-28.
9. De Craene et al. Rilevamento dell’instabilità dei microsatelliti (MSI) in campioni di cancro colorettale con un nuovo set di marcatori altamente sensibili per mezzo del prototipo IdyllaTM MSI Test. Journal of Clinical Oncology 2018; 36:15.

Aggiornato il 23 maggio 2019