2.25.2.3.2(iv) Obiettivi comuni in diversi tipi di cellule cerebrali

L’omeostasi del calcio e la kinasi di segnalazione cellulare calcio-dipendente sono gli obiettivi del piombo più comuni in tutti i tipi di cellule cerebrali. Sebbene gli ioni divalenti di calcio (Ca2+) e gli ioni divalenti di piombo (Pb2+) abbiano proprietà chimiche diverse, dove gli ioni di calcio favoriscono il legame con l’ossigeno e gli ioni di piombo preferiscono il legame con lo zolfo, gli effetti del piombo sull’omeostasi del calcio e sulla segnalazione cellulare mediata dal calcio sono stati concentrati preferibilmente nella storia della tossicità del piombo (per esempio, l’osteoporosi nell’avvelenamento da piombo e le vie di segnalazione della protein chinasi C (PKC)) (Goldstein 1993; Pounds et al. 1991). L’identificazione del piombo fortemente legato a GRP78, una proteina povera di cisteina (Qian et al. 2000), suggerisce che il piombo può anche colpire proteine non ricche di solfidrati. GRP78 è una proteina ricca di acido glutammico e acido aspartico che lega il calcio (17,2% di acido glutammico e acido aspartico rispetto alla media dell’11,7%) (Klapper 1977) e risiede nell’ER e contribuisce al tamponamento del calcio nell’ER, uno dei principali organelli per lo stoccaggio del calcio (Macer e Koch 1988). Il legame del piombo con GRP78 fornisce inoltre forti prove a sostegno del ruolo principale dell’omeostasi del calcio alterata dal piombo e della segnalazione cellulare calcio-dipendente nella neurotossicità da piombo.

L’importanza del calcio nella segnalazione cellulare è ben nota. Il calcio gioca ruoli significativi nella differenziazione neuronale, nella crescita, nella ramificazione, nella migrazione, nell’organizzazione strutturale, nella formazione di sinapsi e nella plasticità sinaptica (Braun e Schulman 1995). L’importanza della segnalazione del calcio è documentata anche nella comunicazione tra astroglia e tra astroglia e neuroni (Scemes e Giaume 2006). Proteine ed enzimi diretti o indiretti calcio-dipendenti sono coinvolti in molte vie di segnalazione cellulare e l’omeostasi del calcio è anche coinvolta nell’apoptosi del sistema nervoso (Alberdi et al. 2005; Polster e Fiskum 2004). La segnalazione cellulare calcio-dipendente è regolata da alterazioni della concentrazione intracellulare di ioni calcio liberi attraverso i canali del calcio (ad esempio, i canali del calcio voltaggio-gettati (VGCC)) o le pompe (ad esempio, la pompa Ca2+-ATPasi) sulla membrana plasmatica o i depositi intracellulari (ad esempio, ER e mitocondri). Al contrario, i cicli di fosforilazione/defosforilazione dei canali del calcio (per esempio, i canali dei recettori VGCC e NMDA) regolati da chinasi/fosfatasi calcio-dipendenti regolano anche le concentrazioni di calcio intracellulari (Lieberman e Mody 1994; Raman et al. 1996). Quindi, i neurotossici, compreso il piombo, possono influenzare l’omeostasi del calcio in molti modi, il che si tradurrà in alterazioni della segnalazione cellulare. Questo argomento è stato esaminato in dettaglio (Audesirk e Tjalkens 2004), e quindi questa sezione si concentrerà sui bersagli comuni di proteine o enzimi calcio-dipendenti e su altri potenziali bersagli comuni.

PKC è una protein chinasi mediata dal calcio coinvolta nella segnalazione cellulare in tutti i tipi di cellule cerebrali (Braun e Schulman 1995). Il piombo stimola la PKC calcio-dipendente attivata da diacilglicerolo e fosfolipidi, parzialmente purificata dal cervello di ratto, e concentrazioni picomolari di piombo sono risultate equivalenti a concentrazioni micromolari di calcio nell’attivazione della PKC (Long et al. 1994; Markovac e Goldstein 1988). Quindi questo enzima regolatore può percepire i livelli di piombo attesi dalle attuali esposizioni ambientali di basso livello. Anche se la maggior parte del piombo trovato nel cervello si deposita nell’astroglia, è possibile che abbastanza piombo possa arrivare ai neuroni e ad altri tipi di cellule cerebrali per modulare l’attività della PKC. Studi su cellule PC12 hanno indicato che livelli di piombo bassi come 10 nmol l-1 hanno aumentato l’attività della PKC, mentre livelli pari o superiori a 10 μmol l-1 hanno diminuito l’attività della PKC. La presenza di glutammato a 500 μmol l-1 ha esacerbato la morte cellulare indotta dal piombo e questo potrebbe essere parzialmente bloccato da 100 nmol l-1 di staurosporina, un inibitore PKC, o 1 μmol l-1 di MK-801, un antagonista NMDA (Jadhav et al. 2000). Risultati simili sono stati osservati anche in altri studi che mostrano che il piombo a 0,53 μmol l-1 ha aumentato l’attività della PKC del 200% dopo 2 ore e poi l’attività è tornata ai livelli di controllo entro 48 ore (Tian et al. 2000). L’importanza dell’attività PKC attivata dal piombo è stata collegata alla differenziazione neuronale. Studi su neuroni ippocampali di ratto in coltura hanno riportato che l’inibizione della PKC con la calfostina C ha esacerbato l’inibizione dell’inizio dei neuriti causata da 100 nmol l-1 di cloruro di piombo (Kern e Audesirk 1995), suggerendo un coinvolgimento della PKC nella neurotossicità del piombo. In contrasto con questo studio, il piombo a 25-100 nmol l-1 ha stimolato la crescita dei neuriti indotta dal NGF nelle cellule PC12, e l’attivazione della protein chinasi regolata dal segnale extracellulare (ERK) è stata trovata coinvolta nella stimolazione del piombo (Crumpton et al. 2001; Williams et al. 2000a). Così, questi risultati opposti riflettono le complessità poste dalla presenza di molteplici vie di iniziazione dei neuriti e molteplici obiettivi dell’avvelenamento da piombo nel sistema nervoso. La tirosina idrossilasi (TH) è un marker di sviluppo della differenziazione neuronale e la sua attività è regolata dalla PKC. L’inibitore PKC Ro32-0342 ha soppresso l’attività TH indotta dal piombo nelle cellule PC12 (Tian et al. 2000). L’ODC è un enzima regolatore chiave della via delle poliammine coinvolto in numerosi processi metabolici nel sistema nervoso in via di sviluppo e maturo. Nella neocorteccia e nel cervelletto di cuccioli di ratto esposti al piombo attraverso l’acqua potabile della madre (0,2% di acetato di piombo) dalla nascita allo svezzamento, l’esposizione al piombo ha attenuato sia l’ODC che le attività della PKC da PND 3 a PND 30. Gli studi sulle cellule PC12 hanno suggerito che l’attenuazione dell’ODC da parte del piombo era dovuta all’attività PKC attenuata dal piombo perché l’attività ODC indotta dal NGF era attenuata dall’inibitore PKC staurosporina (Hilliard et al. 1999). L’attività della PKC era anche coinvolta nell’attività di legame al DNA del fattore trascrizionale Sp1 indotta dal piombo, perché l’inibitore della PKC staurosporina diminuiva il legame al DNA di Sp1 indotto dal piombo nelle cellule PC12, il che era supportato dalla scoperta che l’attività di legame al DNA di Sp1 era modulata in parallelo all’attività della PKC nell’ippocampo dei ratti esposti al piombo (Atkins et al. 2003). Si ritiene inoltre che Sp1 sia coinvolta nell’espressione genica del recettore NMDA (Bai e Kusiak 1995). Il legame al DNA di Sp1 dipendente dalla PKC dovrebbe giocare un ruolo importante nell’espressione modulata dal piombo del recettore NMDA, anche se sono stati riportati risultati controversi da diversi gruppi di ricerca (Cory-Slechta et al. 1997a,b; Guilarte et al. 1993; Lasley et al. 2001; Ma et al. 1997).

Gli studi hanno rivelato che l’attivazione della PKC era coinvolta nel ritardo dell’oligodendrogliogenesi indotta dal piombo. La diminuzione indotta dal piombo della proliferazione e della differenziazione in OPs di ratto in coltura è stata abolita dall’inibizione della PKC con bisindolylmaleimide I, mentre l’effetto dell’agente PKC-attivante phorbol-12,13-didecanoate è stato potenziato dal piombo. Il piombo ha anche causato la traslocazione della PKC dal citoplasma al compartimento della membrana senza un aumento dell’attività totale della PKC cellulare (Deng e Poretz 2002). Sp1 può regolare l’espressione genica di MBP e PLP, due importanti costituenti strutturali della mielina del sistema nervoso centrale (Henson et al. 1992; Tretiakova et al. 1999). Quindi, l’attività di legame al DNA della PKC-dipendente Sp1 è ragionevolmente presunta nelle alterazioni indotte dal piombo dei profili di sviluppo di PLP e MBP (Zawia e Harry 1995).

Anche se nessuna prova diretta ha dimostrato che l’attività di legame al DNA della PKC-dipendente Sp1 sia coinvolta nell’espressione genica di HSP70, HSP90 e GRP78 regolata dal piombo nell’astroglia (Opanashuk e Finkelstein 1995; Qian et al. 2000, 2001; Selvin-Testa et al. 1997), il coinvolgimento di Sp1 e PKC nell’espressione dei geni HSP70, HSP90 e GRP78 (Jacquier-Sarlin et al. 1995; Rebbe et al. 1989; Song et al. 2001; Ting e Lee 1988) implica che il piombo potrebbe modulare l’espressione di questi geni attraverso la regolazione del legame al DNA di Sp1 dipendente dalla PKC. Una correlazione tra PKC e l’espressione di GFAP è stata profilata in linee cellulari astrogliali (Brodie et al. 1998; Masliah et al. 1991). Tuttavia, resta da verificare se la sovraespressione di GFAP indotta dal piombo sia mediata dalla PKC (Harry et al. 1996; Selvin-Testa et al. 1994; Stoltenburg-Didinger et al. 1996; Waterman et al. 1994). Studi sull’uomo condotti su lavoratori al piombo hanno sostenuto l’importanza dell’attività PKC modulata dal piombo nella neurotossicità del piombo, perché il piombo della tibia e la durata dell’esposizione erano significativamente associati all’attivazione PKC degli eritrociti (Hwang et al. 2001). In sintesi, la PKC probabilmente media molti aspetti della neurotossicità indotta dal piombo nel sistema nervoso.

La δ-aminolevulinic acid dehydratase (ALAD) è un enzima chiave che catalizza la conversione dell’acido δ-aminolevulinico (δ-ALA) in porfobilinogeno nella via biosintetica dell’eme. ALAD è un ben noto bersaglio molecolare di esposizione al piombo e la sua attività è inibita del 50% quando i livelli di piombo nel sangue superano 20 μg dl-1. L’inibizione di ALAD indotta dal piombo si traduce in un aumento del livello circolante di ALA. Così, l’attività di ALAD nel sangue e il livello urinario di δ-ALA sono utilizzati per diagnosticare l’avvelenamento da piombo negli adulti con livelli di piombo nel sangue superiori a 35 μg dl-1 e nei bambini con 25-75 μg dl-1. Inoltre, l’aumentato livello circolante di ALA diminuisce il rilascio di GABA nel sistema nervoso centrale, causando neurotossicità da piombo (Patrick 2006b). Sebbene l’inibizione dell’ALAD da parte dell’esposizione al piombo sia identificata negli eritrociti, l’ALAD è espresso in tutti i tessuti, compresi quelli cerebrali, e l’eme è essenziale per la biosintesi dei citocromi necessari per la produzione di ATP nei mitocondri. Inoltre, il motivo di legame allo zinco CysCysHisCys in ALAD ha un’affinità molto più alta per il piombo con un’attività di assorbimento molare di 16 000 mol-1 cm-1, considerevolmente più alta del motivo più comune di zinc finger, CysCysHisHis, con un’attività di assorbimento molare di 700 mol-1 cm-1 in altre proteine o enzimi (Godwin 2001). Pertanto, ci si può aspettare che il piombo inibisca l’attività di ALAD nei tessuti cerebrali, portando alla neurotossicità nel sistema nervoso centrale.