Discussion

Il microbiota umano comprende più di mille specie batteriche distinte e gioca un ruolo importante nella salute umana, promuovendo l’approvvigionamento di nutrienti, impedendo la colonizzazione di patogeni e modellando e mantenendo la normale immunità delle mucose. I batteri intestinali commensali sono stati recentemente apprezzati come aventi un vero rapporto simbiotico con l’ospite; all’interno di questo grande pool di batteri, integratori probiotici contenenti LAB (cioè lattobacilli e bifidobatteri) sono stati rivendicati per avere una varietà di effetti benefici sulla salute umana, come la prevenzione della diarrea e malattie infiammatorie intestinali o profilassi delle infezioni urogenitali. Tuttavia, la nostra conoscenza dei ruoli biochimici che specie e ceppi specifici giocano nella salute e nella malattia umana è fortemente limitata. In questo studio abbiamo mirato ad avanzare la comprensione dei percorsi di riduzione del nitrato in specie batteriche comuni selezionate che colonizzano l’intestino umano utilizzando condizioni in vitro compatibili con diete ricche di nitrati e livelli di ossigeno trovati sulle superfici mucosali del tratto gastrointestinale. I risultati principali della nostra indagine indicano che: 1) E.coli, un anaerobo facoltativo, converte il nitrato in nitrito e successivamente in ammoniaca che si accumula progressivamente nei mezzi di coltura; 2) L.plantarum, un batterio fermentativo, coltivato in presenza di eme esogeno e vitamina K2 eseguire processi simili; 3) E.coli enzimi generare NO significativo da nitrito solo in condizioni anaerobiche; 4) Tutte le culture LAB esaminato generare grandi quantità di acido lattico causando acidificazione sufficiente dei mezzi di coltura per guidare nitrito disproporzione a NO.

La maggior parte degli eucarioti ricava la propria energia principalmente attraverso la fosforilazione ossidativa e deve respirare O2 per la formazione di ATP, tuttavia molti batteri enterici, compresi i ceppi E.coli K12, possono utilizzare NO3- come accettore di elettroni alternativo quando O2 è limitante e il nitrato è abbondante. E.coli rappresenta il membro modello delle Enterobacteriaceae e anche se questa famiglia costituisce solo una piccola frazione del microbiota intestinale, è particolarmente importante perché alcuni ceppi possono causare malattie. È stato anche recentemente dimostrato che il nitrato generato come sottoprodotto dell’infiammazione dell’ospite può essere utilizzato da E.coli durante la respirazione per conferire un beneficio di crescita e superare i microbi residenti nel colon che si basano solo sulla fermentazione. L. plantarum è considerato un probiotico sicuro e si trova comunemente nel tratto intestinale dei mammiferi così come nella saliva umana dove i nitrati sono noti per accumularsi a livelli millimolari a causa del ciclo entero-salivare del nitrato, che rappresenta circa il 25% del nitrato globale circolante. Questo batterio presenta il tipico percorso eterofermentativo facoltativo della famiglia LAB, ma, unico per questa specie, i geni che codificano un sistema putativo nitrato-reduttasi (narGHJI) sono stati recentemente identificati nel genoma di L. plantarum WCFS1, che suggerisce che è in grado di utilizzare il nitrato come accettore di elettroni. Infatti un’analisi genetica recentemente pubblicata di L.plantarum ha evidenziato la sua enorme capacità metabolica diversificata e versatile.

Nei nostri esperimenti è stata rilevata una significativa attività di nitrato reduttasi sia in E.coli, sia in L. plantarum quando la tensione di ossigeno diminuisce dal livello atmosferico verso lo zero. Al contrario, B.longum infantis, un anaerobio microaero tollerante di origine infantile del tratto gastrointestinale, non ha mostrato alcuna capacità di ridurre il nitrato anche ad alte concentrazioni. I bifidobatteri rappresentano fino al 90% dei batteri del tratto gastrointestinale di un neonato e i nostri risultati sono in accordo con l’osservazione che il latte materno umano, che presenta livelli particolarmente elevati di nitriti, fornisce una fonte alimentare di nitriti prima dell’istituzione di microbioti linguali e intestinali capaci di ridurre i nitrati che si trovano normalmente nella flora degli adulti.

Nella Fig. 1 abbiamo mostrato che le colture di E.coli contenenti 5 mM NO3- avevano un vantaggio competitivo di crescita rispetto alle colture senza nitrato aggiunto e poi abbiamo determinato l’effetto dei gradienti di ossigeno e nitrato sulla produzione di nitrito e ammoniaca. I nostri risultati indicano che circa 2,5 mM di NO3- al 4% o meno di O2 è sufficiente per indurre l’espressione degli enzimi nitrato reduttasi e che dopo 24 ore una notevole quantità di nitrito si è accumulata sia all’interno delle cellule di E.coli che nei mezzi di coltura. Un’analisi molecolare dettagliata della regolazione delle attività enzimatiche batteriche trascende lo scopo di questo studio, tuttavia è noto che i ceppi di E.coli K12 esprimono tre nitrato reduttasi contenenti molibdeno e che il tungsteno può disattivare questi enzimi sostituendo l’atomo di molibdeno nel sito attivo. Abbiamo trovato che l’aggiunta di 300 μM di ossido di tungsteno alle culture cresciute come negli esperimenti riportati in Fig. 1 ha quasi completamente abolito la formazione di nitrito (dati non mostrati). Pertanto, riteniamo che le nitrato reduttasi dipendenti dal molibdeno siano responsabili del passo cruciale nella formazione di nitrito. È anche importante notare che E.coli, così come molte altre specie di batteri, sono suscettibili alla tossicità del nitrito a causa della formazione di complessi metallo-nitrosile e minimizzano questa tossicità attraverso l’induzione coordinata di un trasportatore di membrana nitrito e altri enzimi che mediano la riduzione del nitrito. Una descrizione completa dei geni dell’E.coli nitrato e nitrito reduttasi e degli operoni di regolazione ed espressione può essere trovata nelle eccellenti pubblicazioni di Stewart e Cole.

Percorsi di riduzione degli ossidi di azoto nell’intestino umano

La presenza di nitrato e nitrito nel tratto GI inferiore dipende da numerosi aspetti tra cui i tipi di batteri che colonizzano l’intestino e l’intricato equilibrio tra la dieta e i percorsi metabolici degli ossidi di azoto. Tuttavia la produzione endogena di nitrato dall’ossidazione di NO (principalmente attraverso la reazione con l’ossiemoglobina) è stata a lungo riconosciuta come un ordine di grandezza maggiore rispetto all’assunzione con la dieta, come dimostrato alla fine degli anni ’70 e più recentemente in studi che utilizzano topi eNOS-deficienti. Nella rappresentazione schematica di Fig. 5 abbiamo riassunto il legame tra la denitrificazione respiratoria batterica, la riduzione degli ossidi di azoto ad ammoniaca, la via endogena L-arginina/NO sintasi e la riduzione non enzimatica dei nitriti a NO. Nel processo di denitrificazione (riquadro rosso), il nitrato viene ridotto a gas azoto (N2) in un processo a quattro fasi in cui nitrito, NO e protossido di azoto sono accettori di elettroni in reazioni che generano energia. Recentemente è stata dimostrata l’esistenza di una via di denitrificazione completa, che porta alla produzione di N2, nella placca dentale umana e mentre è ancora considerata di minore importanza negli esseri umani, si ipotizza che potrebbe avere un ruolo importante sotto una tensione di ossigeno molto bassa in presenza di nitrato e la formazione di N2 non può essere esclusa nell’intestino umano. La denitrificazione e la riduzione dissimilatoria dei nitrati ad ammoniaca (DNRA, riquadro blu) condividono la prima fase di riduzione da nitrato a nitrito e diverse classi di nitrato reduttasi sono state associate a questa reazione. Nel DNRA il secondo passo è la riduzione diretta da nitrito ad ammoniaca a sei elettroni, che non fornisce energia ma è un processo di detossificazione abbastanza comune nei batteri anaerobi facoltativi. Il DNRA è stato suggerito per rappresentare la via principale del metabolismo dei nitrati nel rumine dei mammiferi. Questo studio ha identificato l’ammoniaca come prodotto della riduzione dei nitrati nei batteri E.coli e Lactobacilli coltivati in presenza di mM di nitrato al 4% di ossigeno o a livelli inferiori.

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La denitrificazione respiratoria può anche generare piccole ma rilevanti quantità di NO come prodotto intermedio ed è stata implicata nella produzione batterica di NO nell’intestino. Altre possibili vie che producono NO sono la conversione acida del nitrito (scatola verde) e l’ossidazione della L-arginina da parte degli enzimi NOS (cerchio marrone). Nella Fig. 4C abbiamo esaminato la dipendenza protonica della disproporzione non enzimatica del nitrito e abbiamo mostrato che diventa rilevante solo quando il pH intracellulare o dei fluidi corporei è inferiore a 5,5. I nostri risultati hanno anche escluso la presenza di enzimi NOS attivi in E.coli e L.plantarum, tuttavia le cellule epiteliali intestinali sono note per produrre NO attraverso l’espressione di entrambe le isoforme NOS endoteliali e inducibili. È interessante notare che la produzione di NO nell’intestino potrebbe essere innescata anche dai processi enzimatici delle perossidasi, che sono abbondanti sulle cellule della mucosa intestinale e hanno dimostrato di utilizzare il nitrito come substrato per produrre NO come parte della loro azione antibatterica.

Crediamo che tutte queste diverse vie di riduzione del nitrato possano coesistere e verificarsi contemporaneamente, tuttavia è probabile che solo un metabolita predomini a seconda delle specifiche condizioni fisiologiche.

Importanza fisiologica della formazione di NO dalla riduzione batterica del nitrato

I nitrati e i nitriti alimentari sono ancora dipinti come possibili sostanze tossiche in molti studi, nonostante la crescente evidenza che la produzione di NO da questi ioni ha importanti implicazioni benefiche per le funzioni cardiovascolari, immunitarie e gastrointestinali. Nell’intestino NO serve diverse funzioni fisiologiche come la regolazione del flusso sanguigno della mucosa, la mobilità intestinale e lo spessore del muco. La sovrapproduzione cronica di NO è stata anche associata alle malattie infiammatorie intestinali ed è probabile che inibisca la crescita di un’ampia varietà di specie batteriche. Studi precedenti hanno lasciato poco chiaro come i batteri intestinali hanno prodotto NO, tuttavia Sobko et al. hanno dimostrato che, in contrasto con i ratti convenzionali, i livelli di NO nell’intestino dei ratti senza germi sono estremamente bassi e quando inoculati con la normale flora batterica la produzione di NO osservata è aumentata di 10 volte.

Nei nostri esperimenti le concentrazioni di ossigeno e protoni hanno determinato il percorso specifico della riduzione del nitrato a NO. I risultati presentati in Fig. 4A indicano che E.coli è capace di attività enzimatica NO in condizioni anaerobiche con concentrazioni di nitrati superiori a 1 mM possibilmente attraverso la denitrificazione o l’enzima periplasmatico citocromo c nitrito reduttasi (Nrf) come proposto da Corker e Poole. Questa generazione di NO, tuttavia è notevolmente ridotto al 2% di ossigeno e diventare nitrato indipendente. Soprattutto, i nostri dati sono coerenti con la relazione di Sobko e colleghi che E. coli generato livelli insignificanti NO durante 24 ore di incubazione con 0,1 mM nitrato. LAB ha prodotto notevoli quantità di NO in risposta all’acidificazione dei media a causa dell’accumulo di acido lattico. La sostituzione del mezzo di crescita con LMRS fresco (pH = 6,5) ha bloccato quasi completamente la capacità delle colture LAB di convertire il nitrito in NO, ma non in E.coli. Le misurazioni del pH intestinale sono comprese tra 5,7 e 7,5, quindi la disproporzione dei nitriti in vivo è probabilmente un aspetto minore e localizzato della produzione di NO. Inversamente, questo percorso è un fenomeno ben stabilito nell’ambiente acido dello stomaco (pH circa 3).

In sintesi suggeriamo che l’NO generato dai batteri intestinali in prossimità della mucosa intestinale può esercitare gli effetti benefici di cui sopra o a livelli più elevati, interferire con queste funzioni. Così la formazione di NO batterico nell’intestino può essere considerato come modulatore di entrambi gli effetti fisiologici e patologici.

Implicazioni fisiologiche della formazione di ammoniaca batterica per la salute

I batteri colonici sono stati conosciuti per produrre ammoniaca dalla deaminazione degli aminoacidi o tramite ureasi, l’idrolisi dell’urea in anidride carbonica e ammoniaca fin dagli studi seminali di Vince et al. nei primi anni 1970 . Più recentemente Cole e colleghi hanno riferito che il prodotto principale della riduzione dei nitriti in E.coli è l’ammoniaca con circa solo l’1% ridotto a NO a pH neutro. I risultati ottenuti nel nostro studio suggeriscono che almeno alcuni batteri intestinali comuni riducono principalmente il nitrito in ammoniaca piuttosto che NO. Nei soggetti sani, in condizioni fisiologiche ordinarie, la maggior parte dell’ammoniaca generata nel tratto gastrointestinale inferiore viene poi escreta nei fluidi corporei e metabolizzata dagli epatociti del fegato dove l’ammoniaca e l’anidride carbonica vengono convertiti enzimaticamente in fosfato di carbamoile, che entra nella serie di reazioni chiamate “ciclo dell’urea” portando alla formazione di urea e alla sua eliminazione da parte del rene (vedi Fig. 5). La concentrazione plasmatica normale di ammoniaca è nell’intervallo di 10-35 μM, tuttavia, quando la produzione di ammoniaca è eccessiva, l’ammoniaca trasportata dal sangue portale può bypassare il fegato portando all’iperammonemia. L’ammoniaca nel sangue permea liberamente attraverso la barriera emato-encefalica e livelli elevati (>100 μM) hanno effetti tossici sul sistema nervoso centrale portando all’encefalopatia e infine al coma. I pazienti con cirrosi epatica sviluppano molto frequentemente l’encefalopatia epatica (HE). In assenza di insufficienza epatica, il coma iperammonemico è stato attribuito alla sepsi da microrganismi capaci di ureasi come la Klebsiella pneumonia. Gli approcci terapeutici classici per l’HE comportano la riduzione dei livelli sistemici di ammoniaca attraverso il trattamento antibiotico (per uccidere i batteri intestinali che producono ammoniaca) e la somministrazione di zuccheri non assorbibili, come il lattulosio e il lattitolo. Nell’intestino crasso il lattulosio viene scomposto dall’azione dei batteri del colon principalmente in acido lattico, e anche in piccole quantità di acido formico e acetico. Questa acidificazione favorisce la formazione dello ione ammonio non assorbibile dall’ammoniaca e riduce la sua concentrazione nel plasma. Non è chiaro in quale misura il nitrato alimentare contribuisca alla concentrazione di ammoniaca nell’intestino e nel sangue, tuttavia suggeriamo l’ipotesi alternativa che la maggiore acidificazione del contenuto del colon dovuta alla presenza di lattulosio favorisca la conversione del microbiota di nitrito a NO invece di ammoniaca attraverso il noto meccanismo acido-dipendente.

Conclusioni

Per oltre 30 anni il destino biologico del nitrato esogeno non poteva essere contabilizzato nei composti contenenti azoto escreti che ammontano a circa il 60% di una dose di nitrato ingerita nell’uomo. I nostri risultati supportano l’idea che il nitrato viene convertito in nitrito e poi in altre biomolecole azotate ridotte come NO, ammoniaca, urea e possibilmente gas azoto dai batteri nella saliva, nello stomaco, nell’intestino tenue e crasso. Domande come la quantità di ammoniaca generata dalla riduzione nitrato-nitrito rispetto ad altri importanti processi, come la deaminazione e l’attività delle ureasi batteriche, richiedono studi metabolici dettagliati negli animali e/o negli esseri umani. Il significato biologico della conversione dei nitrati alimentari nel lume intestinale rimane da stabilire. Tuttavia le diete tradizionali giapponesi e mediterranee, che sono note per avere effetti protettivi cardiovascolari, hanno un apporto medio di nitrati per persona da 2 a 3 volte superiore alla tipica dieta occidentale (negli Stati Uniti corrispondente a circa 40-100 mg/giorno di nitrati). Ulteriori indagini sul legame tra batteri simbiotici, metabolismo degli ossidi di azoto e salute umana sono necessari; tuttavia è chiaro che le vie biologiche del metabolismo dell’azoto nei mammiferi sono più complesse e più importanti che immaginato anche pochi anni fa.