RISULTATI E DISCUSSIONE
Una linea cellulare di melanoma A375 con un costitutivamente attivato MAPK a causa di una mutazione BRAFV600E è stato trattato con inibitore MEK U0126 ad una concentrazione di 25 μM per 8 ore, con conseguente soppressione della fosforilazione ERK (Fig. 1 a). Gli mRNA dei fattori solubili immunosoppressivi, tra cui IL-6, IL-10 e VEGF, sono diminuiti significativamente con il trattamento U0126 (Fig. 1 b), mentre il trattamento DMSO di controllo non ha influenzato la produzione di mRNA di IL-10 e VEGF, e solo leggermente aumentato il livello di IL-6 mRNA. Un’esposizione di 18 ore a U0126 ha anche soppresso la produzione di IL-10, VEGF e IL-6 a livello proteico, indicando che ERKs attivato può essere responsabile della soppressione delle risposte immunitarie locali contro il melanoma producendo questi fattori immunosoppressivi (Fig. 1 c). Inoltre, la soppressione della fosforilazione ERK e l’inibizione della produzione di IL-6, IL-10 e VEGF si è verificato anche dopo aver ridotto la concentrazione del trattamento U0126 a 10 μM (non raffigurato). Durante questo studio, non sono stati osservati effetti citotossici significativi con il trattamento U0126 delle cellule A375. Anche se U0126 è noto per inibire MEK5 oltre a MEK1/2, ERK5 fosforilato, il substrato MEK5, non è stato rilevato nelle cellule A375 (non raffigurato), indicando che la via MEK1/2-ERK1/2 è responsabile degli effetti osservati con il trattamento U0126. Gli effetti soppressivi di U0126 sulla produzione di IL-10 e VEGF sono stati dimostrati anche in altre tre linee cellulari di melanoma con la mutazione BRAFV600E, 624mel, 888mel e 928mel, senza alcuna tossicità cellulare significativa (Fig. 1 d). Poiché queste linee cellulari di melanoma non producono IL-6, la segnalazione MAPK attivata sembra avere un ruolo generale nella produzione dei fattori immunosoppressivi IL-10 e VEGF nelle linee cellulari di melanoma BRAFV600E+.
Riduzione della produzione di fattori solubili immunosoppressivi IL-6, IL-10 e VEGF da linee cellulari di melanoma con MAPK costitutivamente attiva attraverso la mutazione BRAFV600E mediante inibizione della segnalazione MAPK con un inibitore MEK, U0126. (a) L’inibizione della fosforilazione di ERK1/2 è stata rilevata dall’analisi Western blot della linea cellulare di melanoma A375mel con la mutazione BRAFV600E prima e 2, 4, 6 e 8 ore dopo il trattamento con inibitore MEK U0126 ad una concentrazione di 25 μM. (b) Inibizione dell’espressione dell’mRNA per i fattori solubili immunosoppressivi IL-6, IL-10 e VEGF nelle cellule A375. Gli mRNA per vari fattori solubili, tra cui IL-6, IL-10, e VEGF, sono stati misurati mediante RT-PCR quantitativa prima e 2, 4, 6, e 8 h dopo il trattamento con U0126. Il trattamento di controllo è stato eseguito con una soluzione DMSO. I livelli di mRNA ad ogni punto di tempo sono stati normalizzati a GAPDH mRNA e indicato come il valore relativo a quello di 0 h. (c) diminuita produzione di IL-6, IL-10, e proteine VEGF da cellule A375 dopo un trattamento di 18 ore con U0126 ad una concentrazione di 25 μM. L’espressione è stata rilevata da ELISA con i surnatanti della cultura. Il rapporto di vitalità delle cellule trattate con U0126 cellule trattate con DMSO al raccolto era 77%. La produzione di citochine è stata normalizzata al valore di controllo delle cellule trattate con DMSO in base al conteggio delle cellule. Western blot ha mostrato una forte inibizione della fosforilazione di ERK, ma non della proteina STAT3, o la sua fosforilazione a Ser727 e Tyr705. (d) Diminuzione della produzione di IL-10 e VEGF da tre linee cellulari di melanoma con la mutazione BRAFV600E, 624mel, 888mel, e 928mel dopo un trattamento di 18 ore con U0126 ad una concentrazione di 25 μM, che è stato rilevato da ELISA con i surnatanti della cultura. I rapporti di vitalità delle cellule trattate con U0126 cellule trattate con DMSO al raccolto erano 95% per 624mel, 103% per 888mel, e 100% per 928mel. La produzione di citochine è stata normalizzata al valore di controllo delle cellule trattate con DMSO in base al conteggio delle cellule. Western blot ha mostrato una forte inibizione della fosforilazione ERK, ma non della proteina STAT3. Una leggera diminuzione della fosforilazione Ser727 di STAT3 è stata osservata nelle cellule 888mel e 928mel, ma non nelle cellule 624mel. Questi risultati sono rappresentativi di tre o quattro esperimenti indipendenti con risultati simili.
Tuttavia, effetti aspecifici di U0126 sulla produzione di citochine attraverso vie diverse dalla segnalazione MAPK non può essere completamente esclusa da questi esperimenti a causa della leggera diminuzione osservata in STAT3 fosforilazione a Ser727 in 888mel e 928mel (Fig. 1 d). Per confermare il ruolo della MAPK attivata a causa della mutazione BRAFV600E nella produzione di IL-10, VEGF e IL-6, BRAFV600E-specifico RNAi è stato trasfettato in tre linee cellulari di melanoma, A375, 888mel, e 624mel, utilizzando il lentivirus che esprime BRAFV600E-specifico short hairpin RNA (shRNA) (11). L’RNAi specifico per BRAFV600E ha inibito significativamente la produzione di IL-10, VEGF e IL-6 e ha soppresso la fosforilazione di ERK (Fig. 2). Questi risultati confermano che l’inibizione di questi fattori da parte di U0126 (Fig. 1) è correlata all’inibizione specifica della via MAPK. Questi risultati sono coerenti con recenti documenti che mostrano la produzione di IL-10 indotta da ERK1/2 nei macrofagi murini (12) e la produzione di VEGF dipendente da BRAFV600E per la promozione dell’angiogenesi (13).
Riduzione della produzione di fattori immunosoppressivi IL-6, IL-10 e VEGF da tre linee cellulari di melanoma con la mutazione BRAFV600E da BRAFV600E-specific RNAi. Le tre linee cellulari di melanoma con la mutazione BRAFV600E, A375mel, 888mel e 624mel, sono state infettate con i vettori lentivirus che codificano l’RNA a forcina corta per l’mRNA della lucciola luciferasi (GL3B; come controllo) o l’mRNA di BRAFV600E (BRAF#1′) a 50 o 100 molteplicità di infezioni. A 5 o 6 d dopo l’infezione, le proteine sono state estratte e sottoposte ad analisi Western blot. Profonda diminuzione della fosforilazione di ERK1/2 con diminuzione della proteina BRAF è stata osservata dal BRAFV600E-specifico RNAi. Non è stata osservata alcuna differenza significativa nella proteina STAT3 e nella fosforilazione di STAT3 a Ser727 o Tyr705. Una leggera diminuzione della fosforilazione a Ser727 è stata osservata nelle cellule 888mel e 624mel dopo BRAF RNAi. 5 o 6 d dopo l’infezione da lentivirus, un numero uguale di cellule di melanoma è stato distribuito ad una densità di 1-2 × 106 cellule/2 ml, e i surnatanti della cultura dopo 18 h sono stati sottoposti a ELISA per IL-6, IL-10, o VEGF. È stata osservata una profonda diminuzione di IL-6, IL-10 e VEGF. Un risultato rappresentativo di due o tre esperimenti indipendenti con risultati simili è mostrato.
Perché la segnalazione STAT3 attivata è stata determinata per provocare l’evasione immunitaria dal cancro attraverso la produzione di vari fattori tra cui VEGF (8, 9), abbiamo studiato la relazione tra le vie MAPK e STAT3 riguardo alla produzione di fattori immunosoppressivi nella linea cellulare di melanoma A375. La produzione di IL-6, IL-10, e VEGF è stata profondamente inibita da RNAi che mirava solo a BRAFV600E o solo a STAT3 (Fig. 3 a). Nessun chiaro effetto additivo o sinergico è stato osservato limitando contemporaneamente le vie BRAF-MAPK e STAT3 (Fig. 3 a). BRAFV600E RNAi nelle cellule A375 non ha diminuito l’attività di legame al DNA di STAT3 (Fig. 3 b), l’attività del promotore STAT3 (Fig. 3 c), o la fosforilazione di STAT3 sia a Ser727 o Tyr705 (Fig. 2), anche se ERKs sono stati segnalati per essere potenzialmente in grado di fosforilare STAT3 a Ser727 (14). Tuttavia, la fosforilazione di STAT3 può avvenire anche attraverso un percorso ERK-indipendente (15). Nelle cellule 624mel, anche se c’era una leggera diminuzione di Ser727-fosforilato STAT3, attività di legame al DNA (Fig. 3 b) e l’attività del promotore STAT3 (Fig. 3 c) non sono stati influenzati dal BRAFV600E RNAi (Fig. 2). Nelle cellule 888mel, c’è stata una simile diminuzione della fosforilazione Ser727, ma, al contrario, sia l’attività di legame al DNA di STAT3 (Fig. 3 b) che l’attività del promotore di STAT3 (Fig. 3 c) sono diminuite dopo il BRAFV600E RNAi (Fig. 2). Questi risultati suggeriscono che la riduzione dell’attività di trascrizione di STAT3 non è il meccanismo principale che genera la soppressione del fattore immunosoppressivo dalla down-regolazione della segnalazione MAPK in queste linee cellulari di melanoma.
Inibizione della produzione di IL-6, IL-10, e VEGF nelle cellule A375 attraverso la RNAi per BRAFV600E da solo, STAT3 da solo, o entrambi, senza cambiamenti significativi nel DNA-binding e attività del promotore di STAT3. (a) Profonda inibizione di IL-6, IL-10, e la produzione di VEGF in A375 attraverso la RNAi per BRAFV600E solo, STAT3 solo, o entrambi. 5 o 6 d dopo l’infezione, il numero uguale delle cellule è stato distribuito ad una densità di 106 cellule/2 ml, e il surnatante della cultura dopo 18 h è stato sottoposto a ELISA per IL-6, VEGF e IL-10. La diminuzione di BRAF e ERK1/2 fosforilato dal BRAFV600E-specifico RNAi e la diminuzione di STAT3 dal STAT3-specifico RNAi sono stati confermati da analisi Western blot. Un risultato rappresentativo di sei esperimenti indipendenti con risultati simili è mostrato. (b) Nessun cambiamento significativo dell’attività di STAT3 DNA-binding dall’inibizione della segnalazione MAPK con BRAF RNAi in linee cellulari di melanoma. STAT3 attività di legame al DNA è stato esaminato da EMSA degli estratti nucleari da linee cellulari di melanoma con controllo GL3B o BRAF # 1′ trattamento vettore shRNA. Bande specifiche STAT3 indicato dalle frecce scomparso con freddo wild-type STAT3 DNA probe (wt), ma non con mutante STAT3 DNA probe (mt). Solo una leggera diminuzione dell’attività di legame al DNA di STAT3 è stata osservata nelle cellule 888mel. (c) STAT3 reporter saggi in A375, 624mel, e 888mel cellule. 2-4 × 105 cellule con controllo o BRAF # 1′ infezione vettore shRNA sono stati trasfettati con 0,4 μg pSTAT3-TA-Luc e 0,4 μg pRL-SV40 con Effectene Transfection Reagent. 24 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state raccolte e analizzate per l’attività di lucciola e renilla luciferasi. Ogni attività di lucciola luciferasi è stata normalizzata con l’attività di renilla luciferasi. Le barre ombreggiate e le barre di errore indicano la media e la deviazione standard dei saggi in triplicato, rispettivamente. Un esperimento rappresentativo di tre o quattro esperimenti indipendenti è mostrato. La trascrizione guidata da STAT3 non è stata modificata dopo il BRAF RNAi in A375 e 624mel, ma è leggermente diminuita in 888mel.
In seguito, sono stati studiati i potenziali effetti causati dai fattori solubili indotti dalla segnalazione MAPK e STAT3 nel surnatante delle culture A375 sulla maturazione dei DC. Il surnatante delle cellule di melanoma A375 in coltura contiene fattori solubili che inibiscono la maturazione delle DC umane derivate da monociti (MoDC) quando stimolate con ligandi del recettore Toll-like come LPS. L’aggiunta dei surnatanti della coltura A375 alle colture MoDC ad una concentrazione finale del 10-20% ha diminuito significativamente la produzione di citochine infiammatorie, tra cui IL-12 e TNF-α, nelle MoDC così come le molecole di superficie cellulare CD1a e CD83, ma non CD80, CD86, CD40, o HLA-DR sulle MoDC. I supernatanti delle altre tre linee cellulari di melanoma hanno prodotto gli stessi risultati quando aggiunti alle colture MoDC (non raffigurate). L’attività soppressiva dei surnatanti delle cellule di melanoma deriva dalla produzione di IL-6, IL-10, e VEGF perché l’aggiunta di anticorpi specifici per questi fattori ha ridotto l’attività soppressiva dei surnatanti della cultura A375 (Fig. 4 a). Le disparità tra le nostre osservazioni e i risultati precedentemente riportati riguardanti il surnatante di cellule di melanoma B16 murino con un STAT3 attivato che inibisce l’espressione di MHC classe II e CD40 possono essere spiegati da diverse cellule tumorali o specie (8).
Riduzione dell’attività soppressiva dei surnatanti di coltura del melanoma A375 mediante pretrattamento con RNAi per BRAFV600E da solo, STAT3 da solo, o entrambi sulla produzione di IL-12 e TNF-α indotta da LPS dalle DC. (a) La neutralizzazione di IL-6, IL-10 o VEGF nei surnatanti di coltura delle cellule di melanoma A375 ha ripristinato l’inibizione della produzione di IL-12 dalle DC umane stimolate da LPS. Le MoDC umane sono state coltivate con i supernatanti della A375 in presenza o in assenza dell’anticorpo monoclonale per IL-6, IL-10, VEGF, o un anticorpo di controllo isotipo a 1 μg/ml. La produzione di IL-12 nei surnatanti della cultura è stata determinata da ELISA 24 ore dopo la stimolazione LPS a 100 ng/ml. (b) CD14 + monociti sono stati isolati da PBMCs utilizzando MACS e coltivato nei mezzi contenenti RPMI 1640, 10% (vol / vol) FBS, 100 ng / ml GM-CSF, e 50 ng / ml IL-4 con o senza 20% (vol / vol) del surnatante cultura delle cellule A375mel preparato in Fig. 3. (a) La metà dei media, le citochine e il surnatante della cultura sono stati cambiati ogni 2 d. Il giorno 5 della cultura, LPS è stato aggiunto a 100 ng/ml. Dopo 15 h, i surnatanti della cultura sono stati raccolti e sottoposti a ELISA di IL-12 e TNF-α.
L’attività soppressiva dei surnatanti della cultura A375 sulla produzione di IL-12 e TNF-α delle MoDCs trattate con LPS è stata ripristinata pretrattando le cellule A375 con RNAi mirato a BRAFV600E solo, STAT3 solo, o sia BRAFV600E che STAT3 (Fig. 4 b). Anche se il STAT3 RNAi sembrava ridurre l’attività soppressiva dei surnatanti della cultura A375 più del BRAFV600E RNAi, la differenza può essere semplicemente causata da diverse attività RNAi. Tuttavia, è importante notare che non sono stati osservati effetti additivi e sinergici dalla RNAi simultanea-targeting BRAF e STAT3; ancora una volta, indicando i ruoli essenziali di entrambe le vie di segnalazione nella produzione di fattori soppressivi sulla maturazione DC. Sebbene sia stata riportata l’attivazione delle DC dal surnatante della linea cellulare del cancro al colon CT26 murino trasfettata con una forma dominante-negativa di STAT3, possibilmente attraverso l’aumento della produzione di citochine proinfiammatorie, in questo studio non è stata osservata l’attivazione delle DC. Può essere spiegato da un’inibizione incompleta di BRAF e STAT3, nessun aumento della produzione di citochine proinfiammatorie nelle cellule di melanoma BRAF shRNA-trasfettate, o da differenze nelle cellule tumorali o specie.
In sintesi, abbiamo dimostrato per la prima volta un ruolo essenziale della segnalazione MAPK insieme al percorso STAT3 sulla produzione di vari fattori immunosoppressivi nelle linee cellulari di melanoma con MAPK costitutivamente attivo a causa della comune mutazione BRAFV600E. Così, il percorso MAPK può essere un bersaglio molecolare potenzialmente significativo per superare l’evasione immunitaria di vari tumori perché è frequentemente attivato in diversi tipi di cancro, compreso il melanoma senza mutazione BRAFV600E (16, 17).