L’obiettivo generale di questa procedura è di estrarre sequenzialmente RNA e DNA da nuclei di tessuto fissati in formalina con paraffina. Questo è un protocollo per la raccolta di nuclei di tessuto da cui estrarremo sia RNA che DNA. Il vantaggio principale di questo protocollo è che migliora le rese di RNA e DNA da regioni precisamente mirate nel blocco di tessuto.

Questa procedura è in gran parte sviluppata in tessuti di cancro alla prostata archiviati. Può anche essere applicata ad altri tipi di tessuti d’archivio. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di carotaggio del tessuto non sono comunemente usate nei laboratori di ricerca.

La maggior parte dei laboratori di ricerca usa invece sezioni trasversali, che esauriscono i tessuti più velocemente e aggiungono una significativa eterogeneità al campione. Iniziare esaminando il vetrino del microscopio e delineando la regione di interesse con un pennarello permanente a punta fine. Successivamente, tagliare una sezione di pellicola di paraffina abbastanza grande da coprire la regione di interesse sul vetrino da microscopio.

Posizionare quindi la pellicola saldamente sul vetrino, avvolgendo la pellicola sui bordi per evitare che scivoli. Usando un pennarello permanente a punta fine, delineare l’intero tessuto e la regione di interesse all’interno del tessuto. Successivamente, rimuovere la pellicola dal vetrino e trasferirla al blocco di tessuto corrispondente.

Orientare la pellicola capovolgendola o ruotandola in modo che il contorno dell’intero tessuto corrisponda alla forma osservata del tessuto nel blocco. Premere saldamente la sezione della pellicola sulla superficie del blocco per evitare lo slittamento. Utilizzando la punta del pennarello permanente, fare tacche poco profonde ma visibile lungo il contorno della regione di interesse e quindi rimuovere la pellicola.

Poi, pulire il punzone recettore dal 0,6 millimetri punch set immergendo la punta in 1,5 millilitri micro provetta da centrifuga contenente un millilitro di candeggina e scorrere il punzone su e giù più volte. Ripetere il lavaggio con la provetta contenente il 70% di etanolo e poi acqua. Ora premere il punzone pulito nella regione di interesse per una profondità di tre millimetri e ritirare.

Rilasciare il nucleo in una provetta da microcentrifuga a basso legame spingendolo fuori dal punzone con lo stilo. Aggiungere un millilitro di xilene alle provette da microcentrifuga contenenti i nuclei di tessuto e vortexare vigorosamente per dieci secondi. Poi mettere in un blocco di calore impostato a 50 gradi Celsius per tre minuti.

Dopo l’incubazione, centrifugare per due minuti a temperatura ambiente alla massima velocità. Dopo la centrifugazione, mettere i nuclei sul ghiaccio per cinque minuti per solidificare il residuo ceroso. Ora, rimuovere con attenzione la paraffina che si è accumulata intorno al menisco insieme al surnatante utilizzando una punta di pipetta.

Poi, ripetere il trattamento con xilene. Dopo aver rimosso la miscela di paraffina e xilene, aggiungere un millilitro di etanolo al 100% e vortexare vigorosamente per dieci secondi. Dopo aver centrifugato alla massima velocità per due minuti, scartare accuratamente l’etanolo.

Ripetere il lavaggio con etanolo ancora una volta prima di iniziare l’omogeneizzazione. Risospendere i nuclei deparaffinizzati in 700 microlitri di etanolo al 100% prima dell’omogeneizzazione. Utilizzare un omogeneizzatore tessuto motorizzato su un’impostazione media per macinare i nuclei in particelle fini.

Momogeneizzazione accurata dei nuclei di tessuto è necessario per il DNA ottimale e resa RNA. Successivamente, riempire provette separate da 15 millilitri con circa dieci millilitri di candeggina, soluzione neutralizzante di RNasi ed etanolo al 70%. Dopo l’omogeneizzazione del campione, lavare la sonda dell’omogeneizzatore in ciascuna delle soluzioni di pulizia in ordine.

Far funzionare l’omogeneizzatore alla massima velocità durante la fase di lavaggio. Pulire la sonda con un fazzoletto e lasciarla asciugare completamente prima di omogeneizzare il campione successivo. Ispezionare visivamente le lame della sonda per eventuali pezzi di tessuto residui e, se trovati, pulire nuovamente la sonda.

Dopo l’omogeneizzazione, portare il volume del campione a un millilitro con etanolo al 100%, quindi centrifugare alla massima velocità per 15 minuti. Aspirare con cura l’etanolo e asciugare all’aria il pellet per circa 15-20 minuti prima di iniziare l’estrazione della proteinasi K. Risospendere il pellet in 150 microlitri di tampone di digestione della proteinasi K e scuotere le provette per allentare il pellet.

La digestione notturna della proteinasi K è raccomandata per un recupero maggiore del DNA. Aggiungere 10 microlitri di proteinasi K stabile in temperatura e mescolare agitando. Incubare a 56 gradi Celsius per 15 minuti con lieve agitazione.

Incubare le provette in ghiaccio per tre minuti. Dopo il raffreddamento, centrifugare la provetta per 15 minuti alla massima velocità. Successivamente, senza disturbare il pellet, trasferire accuratamente ogni surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga per la purificazione dell’RNA.

Estrarre l’RNA e il DNA utilizzando la procedura ottimizzata nel protocollo scritto, che include un tempo esteso di digestione del tessuto per l’estrazione del DNA. RNA e DNA possono essere recuperati da vecchi campioni di tessuto fissati in formalina e inclusi in paraffina usando questo metodo. Gli acidi nucleici sono stati coestratti da campioni di cancro alla prostata che vanno da tre a 14 anni di età del campione.

La resa media era di 2, 270 nanogrammi di RNA e 820 nanogrammi di DNA. È interessante notare che non c’era una correlazione significativa tra l’età del campione di tessuto e il recupero dell’acido nucleico. Nel complesso, i rendimenti di RNA e DNA erano correlati tra i campioni, anche se nella maggior parte dei casi, è stato recuperato più del doppio di RNA rispetto al DNA.

Per dimostrare le prestazioni del DNA genomico estratto con questo protocollo, gli estratti di DNA convertiti con bisolfito da campioni di cancro alla prostata d’archivio sono stati amplificati mediante PCR specifica per la metilazione. Gli elementi ripetitivi ALU sono stati utilizzati come controllo di metilazione e hanno mostrato poche variazioni tra i campioni. GSTP1, un gene noto per essere ipermetilato nel cancro alla prostata, non ha mostrato alcuna amplificazione rilevabile dalla PCR specifica di metilazione quando è stato utilizzato il DNA estratto da campioni benigni.

I campioni di DNA di pazienti con cancro alla prostata aggressivo hanno mostrato valori di soglia del ciclo QPCR rilevabili che erano inferiori a quelli delle cellule indolenti di cancro alla prostata, indicando una maggiore metilazione di GSTP1 nel cancro alla prostata aggressivo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore per l’RNA, e dopo la digestione notturna, in quattro ore per il DNA se viene eseguita correttamente. Questa tecnica dovrebbe consentire ai ricercatori di patologia molecolare di esplorare biomarcatori di DNA e RNA diagnostici in una varietà di tumori.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare i nuclei di tessuto per l’estrazione di DNA e RNA da aree di interesse mappate con precisione in blocchi di tessuto d’archivio.