ABSTRACT

Analysis of gene expression is a common research tool to study networks controlling gene expression, the role of genes with unknown function, and environmentally induced responses of organisms. La maggior parte degli strumenti analitici utilizzati per analizzare l’espressione genica si basano su un’accurata sintesi e quantificazione del cDNA per ottenere risultati riproducibili e quantificabili. Finora, la maggior parte dei kit commerciali per l’isolamento e la purificazione del cDNA mirano a molecole a doppio filamento, che non rappresentano accuratamente l’abbondanza di trascrizioni. Nel presente rapporto, forniamo un metodo semplice e veloce per purificare il cDNA a singolo filamento, esibendo elevata purezza e resa. Questo metodo si basa sul trattamento con RNasi H e RNasi A dopo la sintesi del cDNA, seguita dalla separazione in colonne di spin di silice e la precipitazione di etanolo. Inoltre, il nostro metodo evita l’uso della DNasi I per eliminare il DNA genomico dalle preparazioni di RNA, il che migliora la resa del cDNA. Come un rapporto di caso, il nostro metodo ha dimostrato di essere utile nella purificazione di cDNA a singolo filamento dal fungo patogeno Sporothrix schenckii.