I buffer dell’acetato di ammonio possono causare vari problemi in laboratorio. Due problemi comuni includono aumenti sorprendenti delle contropressioni HPLC-MS quando si avvia lo strumento dopo la conservazione notturna e difficoltà con la sensibilità MS.
L’aumento della contropressione dello strumento quando si usa l’acetato di ammonio (e il formiato di ammonio) è un problema comune riscontrato sui forum di cromatografia, specialmente quando lo strumento è rimasto fermo durante la notte o nelle prime corse di ogni giorno. I tamponi acquosi ad alta solubilità possono causare una grande quantità di grattacapi. Diventano problematici nell’uso pratico, bloccando i capillari, le precolonne e le fritte finali delle colonne analitiche.
Questi problemi derivano invariabilmente dall’incomprensione della solubilità dei tamponi in mezzi acquosi organici misti. Questo può essere superato usando i dati mostrati nella Figura 1.
Figura 1: Solubilità di cinque tamponi in miscele con acetonitrile. (Adattato con il permesso di Ref. 1)
La figura 1 mostra chiaramente che la solubilità dell’acetato di ammonio in miscele binarie contenenti oltre il 90% di acetonitrile è sempre più limitata nella solubilità, e completamente insolubile in 100% acetonitrile. Mentre l’acetato di ammonio 20mM è il limite di solubilità al 90% di acetonitrile, questo limite cade bruscamente a 10mM di acetato di ammonio (una concentrazione di tampone popolare utilizzato con applicazioni LC-MS) a miscele di acetonitrile 95%. Il superamento di questi limiti di solubilità si traduce in un liquido torbido a causa del sottile precipitato di acetato di ammonio all’interno della soluzione. Questo può bloccare i capillari e le fritte della colonna, causando un aumento della contropressione del sistema. Va inoltre notato che i dati della Figura 1 sono derivati utilizzando un tampone di alta qualità – la solubilità diminuirà se si utilizzano reagenti di sale tampone di qualità inferiore (purezza). Evitare di tentare di sciogliere l’acetato di ammonio in acetonitrile puro, anche se la soluzione può poi avere acqua aggiunto ad esso. Anche se inizialmente può sembrare che il tampone sia solubile, esso cadrà rapidamente dalla soluzione (Figura 2).
Figura 2: Residuo di acetato di ammonio creato quando si “scioglie” l’acetato di ammonio in acetonitrile, seguito dall’aggiunta di acqua per raggiungere il rapporto organico/acquoso richiesto dell’eluente (Fotografia per gentile concessione del dott. Paul Ferguson, Astra Zeneca, Regno Unito).
In un tipico gradiente HPLC in fase inversa, questo non è forse un problema, a meno che, naturalmente, il vostro gradiente vada al >90% di acetonitrile. Tuttavia ci sono altre considerazioni, come le percentuali relative di solvente organico che il tampone acquoso può incontrare quando si miscelano usando sistemi di miscelazione a bassa o alta pressione, quando si iniettano campioni disciolti in alte percentuali di acetonitrile o, nel peggiore dei casi, quando i sistemi vengono lavati con 100% acetonitrile per rimuovere i contaminanti della colonna o per la conservazione notturna.
C’è l’ulteriore considerazione, quando si usa il 100% di acetonitrile per la conservazione della colonna, che grandi spostamenti di pH possono verificarsi nel solvente organico al 100% e bisogna essere consapevoli se questi spostamenti di pH potrebbero portare il pH di conservazione della colonna in un intervallo in cui la dissoluzione della matrice di silice può essere possibile, portando alla formazione di ‘fini’ all’interno della colonna che alla fine porterà a blocchi della colonna (a pH elevato) o alla rimozione dei ligandi di fase legati (a pH basso).
Ammonio acetato come tampone
Molti hanno scelto di utilizzare l’acetato di ammonio come tampone, soprattutto quando si utilizza la rilevazione MS, a causa della sua volatilità intrinseca e della bassa propensione alla contaminazione della fonte API. Tuttavia, essere consapevoli di questa solubilità limitata e regolare la nostra pratica HPLC di conseguenza. Capire se l’uso dell’acetato di ammonio è appropriato per l’esperimento e se un tampone è effettivamente necessario. I requisiti per l’uso e la scelta appropriata e la concentrazione di un tampone sono comunemente fraintesi. L’acetato di ammonio è il caso di indagare gli usi e gli abusi di questo sistema tampone molto amato.
I tamponi sono necessari per resistere a piccoli cambiamenti di pH (principalmente dell’eluente) e per garantire che la colonna HPLC rimanga in uno stato di carica costante (principalmente lo stato di ionizzazione delle specie residue di silanolo sulla superficie del supporto di silice). I cambiamenti di pH possono causare problemi con la stabilità del tempo di ritenzione, la forma dei picchi e (quando si usa l’Electrospray MS) la sensibilità dello strumento. In genere, la più grande “sfida” al pH del sistema verrà dalla miscelazione del diluente del campione con l’eluente nei componenti connettivi tra l’iniettore e la colonna HPLC (o precolonna) e alla testa della colonna. Se il diluente del campione ha un pH diverso, allora l’analita (o una parte delle molecole dell’analita) può cambiare stato di ionizzazione e cromatografare diversamente o rispondere diversamente nell’interfaccia MS come risultato. Tuttavia, è importante comprendere la chimica del nostro metodo analitico per fare scelte critiche sul tipo e sulla concentrazione del tampone. Le concentrazioni di analiti e la quantità di superficie della colonna che richiede il controllo del pH sono abbastanza basse da richiedere solo una concentrazione molto bassa di tampone per mantenere tempi di ritenzione riproducibili, una forma di picco accettabile e la sensibilità di rilevamento.
La figura 3 indica le situazioni in cui l’acetato di ammonio può essere utile sia nella cromatografia che nella spettrometria di massa.
Figura 3: Variazione della capacità tampone per una soluzione acquosa di acetato di ammonio (10mM) con varie proporzioni di acetonitrile (%) (adattato con il permesso di Ref. 2)
In sostanza, ci sono due regioni di buffering quando l’acetato di ammonio 10mM viene aggiunto alla nostra soluzione eluente, e l’ammoniaca diluita o l’acido formico vengono utilizzati per regolare il pH. Senza l’aggiunta dell’acido o della base, la soluzione avrà pochissima capacità tampone.
In soluzione acquosa al 100%, i valori pKa del tampone sono intorno a 4,8 e 9,5. Il tampone è meglio utilizzato intorno a +/- 1 unità di pH dal pKa del tampone, dove la capacità tamponante sarà ridotta a circa il 66%. A 2 unità di pH di distanza dal pKa del tampone, la capacità tampone si riduce a circa il 5%. Per un tampone di acetato di ammonio in acqua, il pH dell’eluente usato per la separazione dovrebbe essere da 3,8 a 5,8 quando si usa l’acido formico come modificatore di pH e da 8,5 a 10,5 quando si usa l’ammoniaca per regolare il pH dell’eluente. L’avvertenza: una volta che l’acetonitrile viene aggiunto al sistema questo intervallo di lavoro cambia e l’intervallo di pH utilizzabile diventa da 5,2 a 7,2 o da 7,9 a 9,9 al 60% di acetonitrile. Per le separazioni a gradiente, il pKa del sistema tampone cambierà costantemente. Il pKa del sistema alla composizione iniziale del gradiente è usato per stimare l’utilità del tampone per la separazione.
Questi intervalli di pH saranno sufficienti per evitare cambiamenti nella misura della ionizzazione dell’analita o cambiamenti di protonazione della colonna? Questa è la domanda chiave.
Per la rilevazione MS, gli analiti ionogenici nella forma ionizzata risulteranno in una buona sensibilità di rilevazione, mentre la gestione della ritenzione in fase inversa attraverso la scelta giudiziosa della fase stazionaria e del tipo e della composizione del solvente organico. Se l’analita è completamente ionizzato agli intervalli di pH suggeriti sopra (e nella Figura 3), allora si otterranno buone prestazioni cromatografiche e di rilevamento. Si noti dalla Figura 1 che la capacità tampone del sistema si riduce con l’aggiunta di acetonitrile, con la capacità tampone che scende al 30% del valore acquoso al 60% di acetonitrile. Il principio chiave con l’uso del buffer in LC-MS è quello di utilizzare il meno possibile per mantenere la riproducibilità del tempo di ritenzione, la forma accettabile del picco e la sensibilità del rivelatore. La concentrazione del tampone influenzerà direttamente la quantità di soppressione ionica incontrata e, di conseguenza, la sensibilità del metodo sarà direttamente influenzata. Per mantenere una buona capacità tampone a concentrazioni più basse, spesso miriamo a lavorare entro +/- 0,5 unità del pKa del tampone.
La tabella 1 mostra gli intervalli di pH consigliati in cui i tamponi di acetato di ammonio saranno utili.
| % MeCN | Campo massimo di capacità del tampone (acido acetico / acetato) | Campo massimo di capacità del tampone (ammonio / ammoniaca) | Capacità del tampone (% rispetto al 100% di soluzione Aq) |
| 0 | 4.2 – 5.2 | 9.0 – 10.0 | 100 |
| 20 | 4.7 – 5.7 | 8.7 – 9.7 | 80 |
| 40 | 5.0 – 6.0 | 8.5 – 9.5 | 50 |
| 60 | 5.6 – 6.6 | 8.3 – 9.3 | 30 |
Tabella 1: Intervalli di lavoro raccomandati per il pH e capacità tampone relative indicative per sistemi eluenti di acetato di ammonio 0,1 mM (aq) / acetonitrile.
Utilizzare gli intervalli di tamponamento della tabella 1 per selezionare il pH dell’eluente in cui l’analita dovrebbe essere ionizzato al 100%. Si noti che la concentrazione del tampone utilizzata per ricavare queste cifre è 0,1 mM, una scelta popolare per la concentrazione del tampone quando si utilizza la rilevazione MS. Per gli analiti basici, il sistema di tamponamento acido acetico/acetato è comune, e il pH dell’eluente è solitamente ben al di sotto del pKa degli analiti basici, garantendo che siano costantemente protonati. Lo stesso può essere vero per gli analiti acidi con il sistema ammonio/ammoniaca, dove gli analiti acidi dovrebbero essere tutti completamente deprotonati. Questo garantirà che i tempi di ritenzione siano costanti, le forme dei picchi siano sane e che la sensibilità della MS sia ottimizzata dal punto di vista della chimica del metodo.
Ci sono grandi lacune negli intervalli di tamponamento efficaci per gli eluenti a base di acetato di ammonio. Cioè, ad una composizione dell’eluente del 20% di acetrontrile (o composizione iniziale del gradiente del 20% di acetonitrile), è probabile che ci sia una minore capacità tampone (sarà necessario utilizzare concentrazioni di tampone più elevate) con un pH dell’eluente inferiore a 4,2, tra pH 5,2 e 9,0 o superiore a 10,0. Ci sono altri metodi in cui il pH dell’eluente viene regolato al di fuori di questi intervalli raccomandati quando si usano tamponi di acetato di ammonio. Considerare l’utilizzo di un sistema tampone diverso – il sistema formulato/acido formico è una scelta popolare a valori di pH dell’eluente inferiori a 4,2.
Si deve sempre usare un tampone?
Se il pH dell’eluente è lontano dal pKa dell’analita, piccoli cambiamenti nel pH dell’eluente avranno un effetto trascurabile sul grado di ionizzazione dell’analita. In queste circostanze, l’uso di un tampone può essere inutile. Per esempio, gli acidi acetici (così come formico, trifluoro e difluoroacetico) hanno una sostanziale capacità di ‘auto-buffering’ un basso pH, e fornire l’analita di base pKa >2 unità di pH superiore e analita acido pKa
Questo è tutto assumendo che gli analiti di base sono analizzati utilizzando un sistema di eluente acido e analiti acidi con un sistema di eluente più base pH per garantire la completa ionizzazione e buona sensibilità MS electrospray. Se si verificano problemi con la contropressione dello strumento, l’instabilità del tempo di ritenzione o la sensibilità di rilevamento MS, allora potrebbe essere utile considerare se un sale tampone è necessario a tutti. L’uso giudizioso di acidi formici o acetici o soluzione di ammoniaca può risolvere qualsiasi problema.
Qualunque sia il caso, prendere tempo per capire la chimica del metodo rispetto al vostro analita pKa, il pH eluente richiesto, e la scelta del sistema tampone utilizzato per raggiungere e mantenere questo pH all’interno del sistema.
Per coloro che non hanno informazioni pKa analita, ci sono una serie di programmi gratuiti disponibili che fanno un lavoro ragionevole di prevedere pKa analita basato sulla struttura. Ampiamente usati nei nostri laboratori sono:
- ChemSketch – https://www.acdlabs.com/resources/freeware/chemsketch/
- MarvinSketch – https://chemaxon.com/products/marvin
Se cercate una comprensione più profonda sui tamponi e il loro uso in HPLC e LC-MS, fate riferimento agli articoli nei riferimenti 3-6.
Solubilità dei tamponi negli eluenti acquosi-organici per la cromatografia liquida a fase inversa, Adam P. Schellinger e Peter W. Carr, LCGC North America Volume 22 Numero 6 Giugno 2004
Considerazioni sui tamponi per LC e LC-MS, Xavier Subirats, Elisabeth Bosch, e Marti Rosés, LCGC North America Volume 27 Numero 11 Novembre 2009
Tamponi per fasi mobili, Parte I – L’interpretazione del pH in fasi mobili parzialmente acquose, LCGC Nord America Volume 20 Numero 11 Novembre 2002
Tamponi in fase mobile, Parte II – Selezione del tampone e capacità, LCGC Nord America Volume 20 Numero 12 Dicembre 2002
Tamponi in fase mobile, Parte III – Selezione del tampone e capacità, LCGC Nord America Volume 21 Numero 1 Gennaio 2003
Tamponi in fase mobile in LC: Effetto del metodo di preparazione del buffer sulla ripetibilità della ritenzione, LCGC Nord America Volume 37, Numero 7, Luglio 2019