Abstract

Sono stati valutati gli effetti di zinco, magnesio e calcio nel plasma seminale sul tempo di gravidanza (TTP) in coppie sane, sui parametri seminali convenzionali e sui parametri di analisi seminale assistita dal computer (CASA). La localizzazione degli ioni di zinco chetabili nel plasma seminale e negli spermatozoi sono stati valutati mediante autometallografia (AMG). Sono state valutate le differenze nella localizzazione dello zinco chelatable in campioni con alto e basso zinco totale. I campioni di sperma di 25 coppie con TTP breve e 25 coppie con TTP lungo sono stati sottoposti ad analisi seminale convenzionale, CASA, misure di zinco e magnesio mediante spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente, e calcio mediante spettrometria di assorbimento atomico alla fiamma. I cationi erano fortemente inter-correlati, ma non è stata trovata alcuna correlazione con il TTP o con i parametri seminali convenzionali. I campioni di sperma con alte concentrazioni di zinco hanno mostrato una motilità statisticamente significativa più povera valutata dai parametri CASA velocità della linea retta e linearità rispetto ai campioni con basso contenuto di zinco. Anche la concentrazione di calcio ha mostrato differenze statisticamente significative per gli stessi parametri, ma l’effetto è stato rimosso inserendo la concentrazione di zinco in un modello di regressione multipla. I campioni di sperma con un alto contenuto di zinco totale hanno mostrato una colorazione più forte del plasma seminale all’AMG. Si suggerisce che alte concentrazioni di zinco seminale hanno un effetto soppressivo sulla motilità progressiva degli spermatozoi (`qualità del movimento’), ma non sulla percentuale di spermatozoi mobili (`quantità del movimento’).

Introduzione

Il contenuto totale di zinco nello sperma dei mammiferi è alto, e lo zinco è stato trovato essere fondamentale per la spermatogenesi. La carenza di zinco è associata all’ipogonadismo e all’insufficiente sviluppo delle caratteristiche sessuali secondarie nell’uomo (Prasad, 1991), e può causare l’atrofia dei tubuli seminiferi nel ratto e quindi il fallimento della spermatogenesi (Millar et al., 1958; Underwood, 1977; Endre et al., 1990). Alte concentrazioni di zinco sono state segnalate per deprimere l’assorbimento di ossigeno nella cellula spermatica (Huacuja et al., 1973; Foresta et al., 1990), e la reazione acrosoma indotta da albumina (Foresta et al., 1990). L’attacco/distacco della testa-coda e la condensazione/decondensazione della cromatina nucleare sono anche influenzati dallo zinco seminale (Kvist, 1980; Bjorndahl e Kvist, 1982). Ci sono stati rapporti contrastanti sull’effetto dello zinco seminale sulla motilità dello sperma (Stankovic e Mikac-Devic, 1976; Danscher et al., 1978; Caldamone et al., 1979; Lewis-Jones et al., 1996). È stato dimostrato che la chelazione degli ioni di zinco influenza la motilità degli spermatozoi (Saito et al., 1967; Danscher e Rebbe, 1974), ed è stato suggerito che lo zinco biodisponibile legato alle proteine vescicolari ad alto peso molecolare piuttosto che lo zinco seminale totale dovrebbe essere una misura dell’effetto dello zinco sulla funzione spermatica (Bjorndahl et al., 1991; Carpino et al., 1998).

Questo studio si concentra principalmente sullo zinco. È stata valutata l’associazione dello zinco seminale, e in una certa misura del magnesio e del calcio, con il tempo di gravidanza (TTP) in coppie sane. Inoltre, è stata valutata la correlazione tra questi cationi divalenti ai parametri seminali convenzionali e ai parametri dell’analisi seminale assistita dal computer (CASA).

L’autometallografia (AMGZn) è un metodo istochimico per la rilevazione degli ioni di zinco e degli ioni di zinco liberamente legati (zinco chelatable) nei tessuti. Sono state studiate le differenze nella localizzazione degli ioni di zinco a livello microscopico leggero e microscopico elettronico negli spermatozoi e nel plasma seminale di uomini con alto zinco totale e basso zinco totale.

Materiali e metodi

Popolazione dello studio

Sono state reclutate 430 coppie tra 52 255 membri di quattro sindacati. I campioni di sperma sono stati ottenuti dalle 430 coppie, la motilità è stata valutata manualmente e con CASA (vedi più avanti), e i campioni sono stati conservati congelati (-20°C) fino a ulteriori analisi. Le coppie senza precedenti esperienze riproduttive sono state arruolate quando hanno interrotto la contraccezione e sono state seguite per un minimo di sei cicli mestruali completi o fino al riconoscimento della gravidanza. Delle 430 coppie, 50 coppie che sono rimaste incinte sono state selezionate per il presente studio: le 25 coppie con il TTP più breve (S-TTP, mediana 1 mese, range 1-2 mesi), e le 25 coppie con il TTP più lungo (L-TTP, mediana 10 mesi, range 7-28 mesi). I campioni di sperma di queste 50 coppie sono stati sottoposti alle analisi seguenti.

Caratteristiche convenzionali dello sperma

I campioni di sperma sono stati ottenuti mediante masturbazione in vasetti di polistirolo sterili da 50 ml dopo 3 giorni di astinenza raccomandata. Dopo la liquefazione i campioni sono stati analizzati a temperatura ambiente secondo i criteri dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (1992).

Il volume è stato misurato in un tubo di vetro Falcon graduato da 10 ml (precisione 0,1 ml). La valutazione manuale della motilità degli spermatozoi è stata eseguita in una camera di conteggio Makler (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israele). Ogni spermatozoo incontrato è stato classificato come segue: a: motilità progressiva rapida, b: motilità progressiva lenta o pigra, c: motilità non progressiva, d: immotilità. Sono stati eseguiti almeno 2×100 punteggi. Se la differenza tra due conteggi consecutivi superava il 10%, venivano eseguiti due nuovi conteggi. La percentuale di spermatozoi mobili è stata definita come gruppo `a + b + c’. La concentrazione è stata misurata in una camera di conteggio Makler, e la morfologia è stata classificata secondo i criteri “rigorosi” di Tygerberg descritti da Kruger et al. (1986) su strisci essiccati all’aria fissati in etanolo ed etere, colorati utilizzando la tecnica di Papanicolaou (Organizzazione Mondiale della Sanità, 1992). La valutazione della morfologia è stata effettuata da un solo tecnico di laboratorio addestrato. La vitalità dello sperma è stata determinata su strisci colorati con eosina-negrosina.

Analisi computerizzata dello sperma

Il materiale per CASA è stato ottenuto come segue: 4,5 μl di spermatozoi freschi e ben mescolati sono stati trasferiti con una pipetta in una camera di conteggio Makler con una profondità di 10 μm. Il campione è stato posto in un microscopio a contrasto di fase Olympus BH-2 (Olympus Denmark A/S, Glostrup, Danimarca) con una piastra riscaldante (37°C) con ingrandimento ×200. Una videocamera Sony DXC-107 (Sony Corp., Tokyo, Giappone) ha trasferito le immagini su un monitor video a colori Sony PVM-1440QM (Sony Corp., Tokyo, Giappone). Le registrazioni delle immagini sono state effettuate su un registratore a cassette JVC HR-D560EG/E (JVC Victor Company of Japan, Tokyo, Giappone). Le registrazioni sono state successivamente analizzate su un Hobson Sperm Tracker (Hobson Tracking Systems Ltd, Sheffield, UK) ad una frequenza di acquisizione di 25 Hz, tempo di inseguimento 2 s (totale di 50 fotogrammi), campo visivo 300×300 μm (permettendo tutti i valori di velocità in linea retta fino a 150 μm/s per essere rilevato). 100 spermatozoi sono stati analizzati per campione.

I seguenti parametri sono stati derivati dalle analisi: velocità curvilinea (VCL), velocità della linea retta (VSL), linearità (LIN), velocità media del percorso (VAP) e ampiezza dello spostamento laterale della testa (ALH).

Determinazione di zinco, magnesio e calcio nello sperma

Seminale zinco, magnesio e calcio sono stati misurati in tutti i 50 campioni. Le concentrazioni di zinco e magnesio nello sperma sono state determinate mediante spettrometria di massa a plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS). Lo strumento era un PQ2+ della Fisons Elemental (Winsford, Cheshire, UK). Un’aliquota di 20 μl è stata diluita 100 volte con una soluzione contenente 5 g/l di ammoniaca al 25% (ARISTAR; Merck, Poole, UK), 0,5 g/l di EDTA (Janssen Chimica, Geel, Belgio) e 0,5 g/l di Triton X-100 (Sigma, St Louis, MO, USA) in acqua Millipore 18 MW. Come standard interno, è stato aggiunto scandio (AccuStandard, New Haven, CT, USA) a una concentrazione finale di 100 μg/l. Tutti i campioni sono stati preparati in duplicato. La calibrazione è stata effettuata utilizzando campioni bianchi, ai quali erano stati aggiunti zinco e magnesio (AccuStandard) a concentrazioni finali di 1, 2 e 3 mg/l, corrispondenti a concentrazioni di 100, 200 e 300 mg/l nei campioni di sperma originali. Questa analisi è stata effettuata in modalità di salto di picco con misure a 24Mg, 66Zn e 45Sc.

La determinazione del calcio è stata effettuata negli stessi preparati utilizzando la spettrometria di assorbimento atomico alla fiamma (FAAS). Lo strumento era un Perkin-Elmer 306 (Norwalk, CT, USA). La calibrazione è stata effettuata per concentrazioni corrispondenti a 100, 200 e 400 mg/l nei campioni di sperma originali. I campioni con alte concentrazioni di calcio sono stati ulteriormente diluiti tre volte per rientrare nella curva di calibrazione.

I limiti di rilevamento, calcolati come tre volte la deviazione standard per 10 campioni bianchi preparati nella stessa occasione dei campioni, erano 1 mg/l per lo zinco, 3 mg/l per il magnesio e 2 mg/l per il calcio (espressi come concentrazioni nei campioni di sperma non diluiti). I coefficienti complessivi di variazione nelle determinazioni, come calcolati dai risultati delle analisi duplicate, erano del 18% per lo zinco, del 32% per il magnesio e del 17% per il calcio.

Sono state effettuate anche preparazioni per la determinazione dello zinco mediante spettrometria di assorbimento atomico alla fiamma (FAAS) in dieci dei campioni. L’analisi di regressione lineare dei risultati ICP-MS contro FAAS ha dato una pendenza di 0,79 (intervallo di confidenza al 95%: 0,58-1,00), un’intercetta di 13 μg/l e r2 di 0,90. I risultati un po’ più alti per le analisi ICP-MS non erano quindi statisticamente significativi.

Sviluppo autometallografico (AMG) di strisci di sperma per l’analisi al microscopio ottico

Cinque campioni con alto (242-308 mg/l) e 5 con basso (38-57 mg/l) contenuto di zinco come determinato da ICP-MS sono stati incubati in solfuro di sodio 0,5% (Bie & Berntsen) per 30 minuti per creare reticoli di solfuro di zinco. Gli strisci della soluzione eiaculato/solfuro sono stati fatti su vetrini risciacquati Farmer. Gli strisci sono stati asciugati all’aria, fissati in glutaraldeide 3% (Bie & Berntsen) per 30 min, e posto in tampone fosfato 0,1 M per 3 × 2 min e una volta in acqua distillata per 2 min.

Gli strisci sono stati poi sviluppati AMG per amplificare in argento i reticoli di zinco solfuro. Lo sviluppatore consisteva in 60 ml di soluzione di gomma arabica filtrata (1 kg sciolto in 2 l di acqua distillata; Bidinger A/S, Aarhus, Danimarca), 10 ml di tampone di citrato di sodio e 0,85 g di idrochinone (Merck, Darmstadt, Germania) sciolto in 15 ml di acqua distillata calda. Immediatamente prima dell’uso, sono stati aggiunti 0,11 g di lattato d’argento (Fluka, Buchs, Svizzera) in 15 ml di acqua distillata e la soluzione è stata mescolata accuratamente.

I vasetti sciacquati contenenti gli strisci di sperma sono stati posti in un bagno d’acqua a 26°C e trasferiti in una scatola a tenuta di luce. Lo sviluppatore AMG appena preparato è stato versato nei vasetti, e gli strisci sono stati sviluppati per 30 minuti nella scatola buia.

Dopo lo sviluppo gli strisci sono stati sciacquati in acqua deionizzata corrente per 10 minuti, messi in tiosolfato di sodio al 5% per 5 minuti, lavati con acqua deionizzata corrente per 2 minuti, post-fissati con etanolo al 70% per 30 minuti, e infine lavati con acqua deionizzata corrente per 2 minuti. La controcolorazione è stata eseguita con una soluzione acquosa di blu di toluidina allo 0,1%, pH 4,0 (1 g di blu di toluidina in 1000 ml di tampone: 614,5 ml di acido citrico monoidrato 0,1 M e 385,5 ml di fosfato di sodio diidrato 0,2 M; Merck, Darmstadt, Germania). Gli strisci sono stati posti per 2 × 2 min in acqua distillata, 3 × 3 min in etanolo al 99%, 3×3 min in xilolo, e infine montati con DEPEX (Merck, Darmstadt, Germania).

Preparazioni di strisci di sperma per l’analisi al microscopio elettronico

Gli strisci di campioni di sperma sono stati preparati come descritto sopra, tranne che non sono stati montati con DEPEX. Dopo la procedura è stato aggiunto lo 0,5% di tetrossido di osmio per 30 min, e gli strisci sono stati posti per 3×2 min in tampone e 1×2 min in acqua distillata. Gli strisci contrastati dall’osmio sono stati studiati al microscopio ottico, e le aree di interesse per ulteriori analisi al microscopio elettronico sono state marcate con un coltello di diamante.

Gli strisci selezionati sono stati disidratati in soluzioni di etanolo graduate e incorporati in Epon (Bie & Berntsen). I blocchi di Epon posizionati sopra le aree di interesse precedentemente marcate sono stati mantenuti a 60°C per 24 ore e poi rotti dagli strisci di vetro. Sezioni semi-sottili (3 μm) sono state tagliate e poste su vetrini di vetro. Dopo le analisi al microscopio ottico, le sezioni selezionate sono state reincollate in Epon, e sono state fatte sezioni ultrasottili e controcolorate con citrato di piombo prima dell’esame in un microscopio elettronico JEOL 100S.

Metodi statistici

Le analisi di regressione multiple sono state applicate ai dati per rilevare l’impatto dei singoli parametri sul risultato. I coefficienti di correlazione di rango di Spearman sono stati calcolati per diverse correlazioni. Per il confronto dei gruppi è stato eseguito il test di Wilcoxon rank-sum per la differenza delle mediane.

Risultati

Nella tabella I sono presentati i contenuti di zinco, magnesio e calcio insieme alla proporzione relativa dei cationi nel plasma seminale. Il confronto delle mediane di questi parametri nei due gruppi S-TTP contro L-TTP mediante test t a due campioni non ha rivelato differenze statisticamente significative per nessuno di questi parametri. Una forte inter-correlazione positiva è stata trovata tra zinco, magnesio e calcio (i coefficienti di correlazione di rango di Spearman erano 0,79-0,86, P < 0,01) (Figura 1).

Nessuno dei cationi era strettamente correlato a nessuno dei parametri seminali convenzionali. Quando si esegue l’analisi di regressione multipla su tutti i dati solo il contenuto di zinco è venuto fuori con un valore P inferiore a 0,05 per i seguenti parametri CASA: VSL 0,04 e LIN 0,008. L’inserimento di magnesio o calcio nel modello non ha migliorato i valori.

I campioni di sperma sono stati divisi in due gruppi di uguali dimensioni in base allo stato di ciascun catione. Sono stati identificati i seguenti punti di divisione (mediane per tutti i 50 campioni): zinco 112 mg/l, magnesio 98 mg/l e calcio 476 mg/l. Sono state rilevate alcune differenze statisticamente significative tra i due gruppi (tabella II). I valori P per i gruppi di zinco indicavano le differenze maggiori, i gruppi di calcio avevano differenze intermedie, e i gruppi di magnesio mostravano solo scarse differenze (tranne LIN).

Per la proporzione relativa tra i cationi (Tabella III) i punti di divisione erano: zinco:magnesio 1,26, e zinco: calcio 0,22. I campioni con un rapporto zinco:calcio superiore a 0,22 hanno mostrato valori statisticamente significativi più bassi per i parametri CASA VSL, LIN e STR rispetto ai campioni con un rapporto inferiore a 0,22. La correlazione zinco:magnesio è di 0,86 (coefficiente di correlazione del rango di Spearman), e per zinco:calcio è di 0,79. Il contenuto di zinco sembra essere più strettamente associato al contenuto di magnesio che di calcio, il che potrebbe spiegare la differenza tra i gruppi.

Valutando il contenuto di ioni di zinco nelle preparazioni AMG, è stata rilevata una differenza a livello microscopico nei campioni con basso zinco totale rispetto ai campioni con alto zinco totale. La figura 2 mostra le differenze nella colorazione AMG in un campione con 299 mg/l e un campione con 53 mg/l di zinco seminale. Colorazione intorno al acrosoma, la coda e nel plasma seminale è stato trovato per essere sparse nei campioni con basso zinco totale. Non è stato possibile confermare questi risultati a livello di microscopia elettronica (Figura 3A), e in particolare non è stata vista alcuna differenza nella colorazione intracellulare degli spermatozoi. Le figure 3B e 4 mostrano la localizzazione dello ione zinco nella coda degli spermatozoi. Si trova in tutta la coda concentrata nelle fibre accessorie flagellari e nella membrana. Nel plasma seminale sono stati trovati corpi micrometrici ricchi di ioni di zinco (Figura 5).

Discussione

Questo è, per quanto ne sappiamo, il primo studio che valuta l’impatto dello zinco seminale, del magnesio e del calcio sui parametri TTP e CASA in esseri umani sani. È stata trovata un’associazione tra alte concentrazioni di zinco e bassa linearità dei movimenti dello sperma, espressa da una diminuzione di VAP, VSL, STR e LIN. Le concentrazioni di magnesio e calcio erano strettamente correlate alla concentrazione di zinco, ma non erano così fortemente associate ai parametri CASA. La concentrazione motoria non è risultata influenzata dalla concentrazione totale di zinco, magnesio e calcio. Tuttavia, le differenze sono state trovate tra alto rispetto a basso contenuto di zinco e alcuni parametri CASA (Tabella II). Confrontando i 25 campioni di sperma con lo zinco totale più basso (mediana 72 mg/l) con i 25 campioni con lo zinco seminale totale più alto (mediana 187 mg/l) il test Wilcoxon rank-sum ha rivelato una differenza statisticamente significativa nelle mediane per VSL (P = 0,004) così come LIN (P = 0,001). Per VAP la differenza era anche significativa (P = 0,02). Nessuna differenza è stata trovata per VCL. Poiché non c’erano differenze nella percentuale di motilità o nella concentrazione di motilità nei campioni a basso e alto contenuto di zinco, sembra quindi che un ambiente ricco di zinco faccia muovere le cellule spermatiche in modo più casuale e meno in avanti. Non sembra ridurre il numero di spermatozoi mobili.

VSL esprime quanto avanti la cellula spermatica si muove in una certa quantità di tempo, ed è molto probabile, da un punto di vista clinico, essere il più importante parametro CASA. Uno studio di Moore e Akhondi (1996) sulla capacità di fecondazione degli spermatozoi epididimali di ratto ha dimostrato che un calo del VSL è altamente correlato negativamente all’esito della fecondazione in vitro.

Nel corso degli anni si è discusso molto sul ruolo dello zinco del plasma seminale sulle funzioni dello sperma. La testa dello spermatozoo accumula una concentrazione molte volte superiore a quella del plasma seminale, e lo zinco è essenziale per la stabilità della cromatina e la capacità della cromatina di decondensarsi al momento opportuno (Kvist, 1982; Kvist e Bjorndahl, 1985; Kvist et al., 1987, 1988), ed è stato suggerito un ruolo fisiologico dello zinco come conservatore per un meccanismo inerente al distacco testa-coda (Bjorndahl e Kvist, 1982). Ci sono stati rapporti contrastanti sull’effetto dello zinco seminale sulla motilità dello sperma, però, e la maggior parte degli studi hanno affrontato valutazioni quantitative. In uno studio di Lewis-Jones et al. (1996), in 1178 pazienti inviati per un trattamento di fertilità sono state misurate le concentrazioni di zinco e fruttosio nel plasma seminale, ma per lo zinco non è stata trovata alcuna correlazione statisticamente significativa con la motilità. Abou-Shakra et al. (1989) hanno misurato diversi oligoelementi nel plasma seminale utilizzando ICP-MS, ma non ha rilevato alcuna correlazione della concentrazione di zinco seminale sia per la densità di sperma o la motilità in maschi normospermici, oligospermici o azoospermici. Le concentrazioni di zinco nel loro studio erano simili ai livelli presentati in questo studio. Danscher et al. (1978) hanno riportato alte concentrazioni di zinco da associare alla motilità spermatica depressa, mentre altri hanno riportato un alto contenuto di zinco nel plasma seminale da associare ad un alto grado di motilità delle cellule spermatiche (Stankovic e Mikac-Devic, 1976; Caldamone et al., 1979).

In questo studio ci siamo occupati sia delle valutazioni quantitative dello zinco totale che della determinazione qualitativa della localizzazione dello ione zinco nella cellula spermatica e nel liquido seminale. Anche se non sono state rilevate differenze nel contenuto di ioni di zinco degli spermatozoi a livello ultrastrutturale (Figura 2A) tra i campioni con alto o basso zinco totale, le caratteristiche viste a livello microscopico leggero (Figura 1) potrebbero riflettere una relazione tra la quantità totale di zinco e ioni di zinco liberi nel plasma seminale. In studi recenti Lewis-Jones et al. (1996) e Carpino et al. (1998) hanno concluso che lo zinco seminale totale è un marcatore inaffidabile dell’attività spermatogenica, e suggeriscono che gli ioni di zinco biodisponibili legati a proteine vescicolari ad alto peso molecolare siano un indice migliore. Il metodo AMG qui presentato dimostra lo zinco chebile, cioè gli ioni di zinco nel plasma o lo zinco liberamente legato alle macromolecole. Lo zinco legato saldamente alle proteine non sarà rilevato dall’AMG e non può essere chelato. Siamo d’accordo con gli studi citati che è lo zinco biodisponibile (quindi chetabile) che esercita funzioni sulle cellule spermatiche, compresa la motilità. Questo studio indica che le concentrazioni di zinco totale e di zinco chetabile sono correlate. Ulteriori studi sono necessari, e l’analisi computerizzata delle immagini, ad esempio delle preparazioni AMG, potrebbe essere uno strumento importante.

In contrasto con gli effetti dello zinco, un’alta concentrazione di magnesio in sé non sembra avere alcun effetto inibitorio sulla motilità dello sperma. Un effetto negativo su LIN è stato trovato, ma non era abbastanza grande da avere un impatto sugli altri parametri CASA. È stato riportato che il plasma seminale umano contiene granuli secretori e vescicole di origine prostatica che potrebbero avere un effetto regolatore sulla motilità spermatica modulando la concentrazione di cationi essenziali nel loro ambiente (Stegmayr et al., 1982). Le membrane di questi organelli contengono Mg2+- e Ca2+-dipendente ATPasi competitivamente inibita da Zn2+ (Ronquist et al., 1978a,b). Alta correlazione positiva tra zinco e magnesio nel plasma seminale è stato precedentemente riportato (Papadimas et al., 1983; Umeyama et al., 1986), e in questo studio simili forti intercorrelazioni tra tutti e tre cationi sono stati trovati (r = 0.79-0.86, P < 0.01).

Calcio è importante per la fisiologia dello sperma tra cui motilità (Morton et al, 1974; Lindemann et al., 1987), il metabolismo (Peterson e Freund, 1976), la reazione acrosoma e la fecondazione (Yanagimachi e Usui, 1974; Yanagimachi, 1981). Il ruolo del calcio seminale nella motilità degli spermatozoi non è, tuttavia, completamente compreso. Thomas e Meizel (1988) hanno scoperto che la chelazione di ioni di calcio extracellulare con EGTA inibisce la reazione acrosoma, ma allo stesso tempo non ha effetto sulla motilità. L’aggiunta dello ionoforo ionomycin, che induce la reazione acrosomica, non ha avuto alcun effetto sulla motilità, ma ha aumentato significativamente il numero di spermatozoi che reagiscono all’acrosoma. Magnus et al. (1990) non hanno trovato alcuna associazione tra le concentrazioni di calcio ionizzato e la proporzione di spermatozoi che mostrano un movimento progressivo. Arver e Sjöberg (1982) hanno riportato che un calcio ionizzato basso è associato a un maggior numero di spermatozoi con movimento progressivo. Prien et al. (1990) hanno confrontato la motilità, la velocità e il movimento progressivo degli spermatozoi con il calcio totale e ionizzato in pazienti con motilità normale (>60%) e ridotta (<60%). Non è stata trovata alcuna differenza nel calcio totale, ma una diminuzione statisticamente significativa del calcio ionizzato seminale è stata trovata in quegli uomini con motilità diminuita. In questo studio è stato misurato il calcio totale, ma la capacità di legare il calcio del plasma seminale non è nota. Come per il calcio, non è stato rilevato alcun impatto sulla concentrazione motile, e le correlazioni con i parametri CASA erano più deboli di quelle per lo zinco (Tabella II). Sia VSL che LIN hanno mostrato correlazioni inversamente significative con la concentrazione totale di calcio (P = 0,02 per entrambi), mentre VCL non è stato influenzato. Ma l’aggiunta della concentrazione di zinco in un’analisi di regressione multipla ha rimosso gli effetti della concentrazione di calcio totale sulla motilità. Questo è in accordo con lo studio precedentemente menzionato di Prien et al. (1990). In questo studio i campioni con un basso rapporto zinco:calcio hanno mostrato valori CASA (VSL, LIN e STR) statisticamente significativi migliori rispetto a quelli con un rapporto elevato. Ciò è dovuto principalmente alle differenze nella concentrazione di zinco.

La precisione delle determinazioni di zinco, magnesio e calcio in questo studio era relativamente scarsa, con coefficienti di variazione del 18, 32 e 17%, rispettivamente. La ragione è probabilmente la disomogeneità dei campioni, che in combinazione con i piccoli volumi di campione (20 μl) può aver compromesso la precisione. Nonostante la grande imprecisione, la variazione generata nelle determinazioni di zinco e magnesio era minore rispetto al grande intervallo di concentrazione nei campioni.

È stato precedentemente dimostrato che la chelazione degli ioni di zinco influenza la motilità dello sperma nell’uomo (Danscher e Rebbe, 1974), nel ratto e nel cane (Saito et al., 1967; Stoltenberg et al., 1997). Attualmente sono in corso studi con la chelazione intra ed extracellulare di ioni di zinco, e questo potrebbe rivelare l’importanza della localizzazione degli ioni di zinco nel liquido seminale e nella cellula spermatica.

Gli autori desiderano ringraziare H.Brandstrup, D.Jensen, K.Lunding, K.Wiedemann, Anna Akantis e A.Meier per l’assistenza tecnica. Il Danish Fecundity Study Group ha sostenuto questo studio che fa parte di uno studio collaborativo di follow-up sui determinanti ambientali e biologici della fertilità. Il progetto è coordinato dallo Steno Institute of Public Health, Università di Aarhus, ed è intrapreso in collaborazione con il Dipartimento di Crescita e Riproduzione, National University Hospital di Copenhagen. Lo studio è stato sostenuto principalmente da una sovvenzione della Fondazione di ricerca dell’Università di Aarhus (J 1994-7430-1). Un ulteriore sostegno è stato dato anche dal Consiglio danese per la ricerca medica (J 12-2042-1), la Fondazione danese per l’assicurazione sanitaria (J 11/243-91, J 11/236-93), Fonden til Lægevidenskabens Fremme (A.P.Møller) e la Fondazione Ciconia.