Ammonium acetate buffersは、ラボでさまざまな問題を引き起こす可能性があります。
酢酸アンモニウム（およびギ酸アンモニウム）を使用したときの装置の背圧の上昇は、クロマトグラフィーのフォーラムでよく見られる問題で、特に装置が一晩放置されていた場合、または毎日の最初の数回の実行時に起こります。 溶解度の高い水性バッファは、頭を悩ませる原因となることがあります。 キャピラリ、プレカラム、分析カラムのエンドフリットをブロックするなど、実用上問題となります。
これらの問題は常に、混合有機水性媒体におけるバッファーの溶解度を誤解していることに起因しています。
Figure 1: Solubility of five buffers in mixtures with acetonitrile.に示すように、図1のデータで克服することができる。 (文献1より許可を得て引用)
図1は、90%以上のアセトニトリルを含む二元混合液における酢酸アンモニウムの溶解度が次第に制限され、100%のアセトニトリルでは完全に不溶となることを明確に示している。 90%アセトニトリルでは20mM酢酸アンモニウムが溶解度の限界であるが、95%アセトニトリルでは10mM酢酸アンモニウム（LC-MSアプリケーションでよく用いられるバッファ濃度）にまで急激に低下する。 この溶解度の限界を超えると、溶液中に微細な酢酸アンモニウムが析出し、液体が濁ってしまう。 これは、毛細管やカラムのフリットを塞ぎ、システムの背圧を上昇させる原因となることがある。 また、Figure 1 のデータは高品質のバッファーを用いて得られたものであり、低品質（純度）のバッファー塩試薬を使用した場合、溶解性が低下することに留意する必要があります。 酢酸アンモニウムを純粋なアセトニトリルに溶解させることは、たとえその溶液に水が加えられていたとしても、避けるようにしてください。
Figure 2: Ammonium acetate を acetonitrile に「溶解」し、溶離液の有機物/水性比を求めるために水を追加すると生じる残基 (Photograph courtesy of Dr. Dr.All Rights Reserved) 。 典型的な逆相HPLCグラジエントでは、グラジエントが>90%アセトニトリルでない限り、これはおそらくそれほど問題ではありません。 しかし、低圧または高圧の混合システムで混合する場合、高濃度のアセトニトリルに溶解したサンプルを注入する場合、最悪の場合、カラムの汚染物質を除去するために100%アセトニトリルでシステムをフラッシュする場合など、水性バッファーの有機溶媒の相対割合など、他の検討事項があります。
さらに、100%アセトニトリルをカラム保管に使用する場合、100%有機溶媒中で大きなpHシフトが起こりうることを考慮し、これらのpHシフトによってカラム保管pHがシリカマトリックスの溶解が起こりうる範囲になり、カラム内に「微粉」が形成されて、最終的にカラム閉塞（高pH時）または結合相リガンドの剥離（低pH時）に至るかどうかに注意する必要があります。
Ammonium Acetate as a Buffer
Many chose to use as a buffer, especially when using MS detection, due to its inherent volatility and low propensity for API source contamination.酢酸アンモニウムは、その固有の揮発性とAPIソースの汚染傾向から、バッファとして使用することにしました。 しかし、この溶解度の制限に留意し、それに応じてHPLCの実践を調整する必要があります。 酢酸アンモニウムの使用が実験に適切かどうか、また実際にバッファが必要かどうかを理解する。 バッファーの使用条件、適切な選択と濃度は、一般的に誤解されています。
バッファーは、pHのわずかな変化（主に溶離液の）に耐え、HPLCカラムが一定の電荷状態（主にシリカ担体の表面に残留するシラノール種のイオン化状態）を維持できるようにするために必要とされています。 pHの変化は、保持時間の安定性、ピーク形状、および（エレクトロスプレーMSを使用する場合）装置の感度に問題を生じさせる可能性があります。 一般的に、システムのpHに対する最大の「課題」は、インジェクタとHPLCカラム（またはプレカラム）の間の接続部品およびカラムのヘッドでサンプル希釈液と溶離液が混合されることから生じます。 サンプル希釈液のpHが異なると、分析対象物（または分析対象物分子の一部）のイオン化状態が変化し、クロマトグラフが異なったり、結果としてMSインターフェースでの反応が異なる可能性があります。 しかし、バッファーの種類と濃度について重要な選択をするためには、分析法の化学的性質を理解することが重要です。 pH制御を必要とする分析対象物の濃度とカラム表面の量は十分に低いため、再現性のある保持時間、許容可能なピーク形状、検出感度を維持するには、非常に低い濃度のバッファしか必要ありません。
図3は、酢酸アンモニウムがクロマトグラフィーと質量分析の両方で使用可能な状況を示しています。
図3：酢酸アンモニウム水溶液（10mM）のアセトニトリル比率（％）による緩衝能の変化（文献より許可を得て掲載）。 2）
溶離液に10mMの酢酸アンモニウムを加え、希アンモニアかギ酸でpHを調整する場合、本質的に2つの緩衝領域が存在します。 酸または塩基を加えなければ、溶液はほとんど緩衝能を持ちません。
100%水溶液では、緩衝剤のpKa値は約4.8および9.5です。 緩衝液は、緩衝液のpKaから±1pH単位付近で最もよく使用され、緩衝能は約66%に減少します。 緩衝液のpKaから2pH単位離れると、緩衝能は5%程度に低下します。 水中の酢酸アンモニウム緩衝液の場合、分離に用いる溶離液のpHは、pH調整剤としてギ酸を用いる場合は3.8～5.8、アンモニアで溶離液のpHを調整する場合は8.5～10.5が望ましいとされています。 ただし、アセトニトリルを添加すると、この使用範囲は変化し、使用可能なpH範囲は5.2～7.2、60%アセトニトリルでは7.9～9.9となる。 グラジエントセパレーションでは、バッファーのpKaは常に変化しています。
これらのpH範囲は、分析対象物のイオン化の程度やカラムのプロトン化の変化を避けるために十分でしょうか？
MS検出の場合、イオン化した状態のイオン化性化合物は良好な検出感度をもたらし、固定相と有機溶媒の種類および組成の賢明な選択により逆相保持を管理することができます。 分析対象物が上記（および図3）のpH範囲で完全にイオン化していれば、良好なクロマトグラフィーおよび検出性能が得られます。 図1から、アセトニトリルを添加するとシステムのバッファ容量が減少し、60%アセトニトリルでは水溶液の30%まで減少することに注意してください。 LC-MSにおけるバッファーの使用は、保持時間の再現性、許容できるピーク形状、検出器の感度を維持するために、できるだけ少ない量で行うことが重要な原則です。 バッファーの濃度は、イオンサプレッションの量に直接影響し、したがってメソッドの感度にも直接影響します。 低濃度のバッファで良好な緩衝能力を維持するために、バッファのpKaの±0.5単位以内の範囲で作業することをしばしば目指します。
| % MeCN | 最大バッファ容量範囲（酢酸 / Acetate） | 最大バッファ容量範囲（アンモニウム / Ammonia） | バッファ容量（% Aq 100% solutionに対して） | |
| 0 | 5.0 | 5.02 – 5.2 | 9.0 – 10.0 | 100 |
| 20 | 4.7 – 5.7 | 8.7 – 9.7 | 80 | |
| 40 | 5.0 – 6.0 | 8.5 – 9.5 | 50 | |
| 60 | 5.6 – 6.6 | 8.3 – 9.3 | 30 |
表1.環境負荷低減への取り組み。 0.1mM 酢酸アンモニウム（aq）/アセトニトリル溶離液系での推奨pH範囲と相対緩衝容量
Table 1の緩衝範囲を使って、分析対象物が100%イオン化される溶離液pHを選択します。 これらの数値を導き出すために使用したバッファーの濃度は0.1mMであり、MS検出を使用する場合のバッファーの濃度として一般的な選択であることに注意してください。 塩基性化合物の場合、酢酸/酢酸緩衝系が一般的で、溶離液のpHは通常、塩基性化合物のpKaよりかなり低く、常にプロトン化されていることが保証されます。 アンモニウム/アンモニア系でも同様に、酸性分析物はすべて完全に脱プロトン化されることが望ましいと考えられる。 これにより、保持時間が安定し、ピーク形状が健全になり、メソッドケミストリーの観点からMS感度が最適化されます。
酢酸アンモニウムベースの溶離液の有効緩衝範囲には、大きなギャップがあります。 すなわち、20%アセトニトリル溶離液組成(または20%アセトニトリルの開始グラジエント組成)では、溶離液pH4.2未満、pH5.2～9.0または10.0以上で緩衝能力が低くなると考えられます(より濃度の高いバッファを使用する必要があるでしょう)。 酢酸アンモニウムバッファーを使用する場合、溶離液のpHがこれらの推奨範囲外に調整される他の方法もある。
Should A Buffer Always Be Used?
溶離液のpHが分析対象物のpKaと離れている場合、溶離液のpHのわずかな変化は分析対象物のイオン化に無視できない影響を与えることになります。 このような場合、バッファーは必要ありません。 例えば、酢酸（ギ酸、トリフルオロ酢酸、ジフルオロ酢酸も同様）は、低pHでかなりの「自己緩衝能」を持ち、塩基性分析物のpKa >2 pHユニット高、酸性分析物のpKa
これはすべて、完全なイオン化と優れたエレクトロスプレーMS感度を確保するために、酸性分析物は酸性溶離液系で、酸性分析物はより塩基性の溶離液系pHで分析すると仮定した場合の話です。 装置の背圧、保持時間の不安定性、MSの検出感度に問題がある場合、緩衝塩が必要かどうかを検討する価値は十分にあります。
どのような場合でも、分析物のpKa、必要な溶離液のpH、およびシステム内でこのpHを達成し維持するために使用する緩衝系の選択に関して、メソッドの化学を理解する時間を取る必要があります。 私たちの研究室では、
- ChemSketch – https://www.acdlabs.com/resources/freeware/chemsketch/
- MarvinSketch – https://chemaxon.com/products/marvin
HPLCおよびLC-MSにおけるバッファおよびその使用についてより深く理解したい場合は、文献3～6の記事を参照してください。
Reversed-Phase Liquid Chromatographyにおける有機溶媒へのバッファーの溶解度、Adam P. Schellinger とPeter W. Carr, LCGC North America Volume 22 Number 6 June 2004
Buffer Considerations for LC and LC-MS, Xavier Subirats, Elisabeth Bosch, and Marti Rosés, LCGC North America Volume 27 Number 11 November 2009
Mobile-Phase Buffers, Part 1 – The Interpretation of pH in Partially Aqueous Mobile Phases, LCGC North America Volume 20 Number 11 November 2002
Mobile-Phase Buffers, Part II – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 20 Number 12 December 2002
Mobile-Phase Buffers, Part III – Buffer Selection and Capacity, LCGC North America Volume 21 Number 1 January 2003
LCにおける移動相バッファの研究開発(第2部、第23部)。 保持反復性に及ぼすバッファ調製法の影響，LCGC North America Volume 37, Issue 7, July 2019.