1960年代、腸の糖吸収の生理学において2つのマイルストーンが達成された。 一つはCraneらによるNa+-グルコース共輸送仮説（1）で、これは活発な糖輸送を説明するものであり、もう一つは患者におけるグルコースおよびガラクトース吸収不良（GGM）の発見である（5, 6）。 この共輸送仮説は、大腸菌の乳糖蓄積から甲状腺のヨウ化物蓄積まで、様々な基質の細胞内への「能動輸送」を網羅的に検証、確認し、拡張されてきた。 基本的に、共輸送体は、細胞膜を横切るイオン電気化学的電位勾配の形で蓄えられたエネルギー、Na+またはH+を利用して、細胞内に特定の溶質と水の蓄積を駆動する分子機械である(22)。 腸管Na+-グルコース共輸送体（SGLT1）は、膜を介したNa+と電気化学的勾配を利用して、その濃度勾配に逆らって糖と水を腸管細胞内に駆動する（9, 13, 23）。 グルコースとガラクトースはSGLT1によって処理されるが、フルクトースは独自の輸送体であるfacilitated fructose transporter (GLUT5) によってブラシボーダーを通過して輸送される。
図1.ブラシボーダーSGLT1およびGLUT5トランスポーターと、基底側Na+-K+ポンプおよび糖トランスポーターGLUT2を示す腸細胞内の糖輸送のモデル（図1）。 GGMは、新生児期に水様性、酸性性の激しい下痢を発症し、食事から乳糖（グルコースとガラクトース）を除去しないと数週間で致死的となることが特徴である（2）。 下痢は、絶食または食事から問題となる糖質を除去すると停止するが、乳糖、グルコース、ガラクトースを含む食餌を経口投与すると、すぐに再開される。 果糖の吸収には影響がない。 この病気の症状と、当時知られていた腸の糖吸収に関する知識から、GGMはブラシボーダーのNa+-グルコース共輸送体の欠陥に起因することが予想された。 この仮説は、最初のアメリカ人GGM患者の粘膜生検で行われた精巧なオートラジオグラフィーのガラクトース取り込みとフロリジン結合実験によって強化された（17, 18）。 これらの実験から、ガラクトース輸送の減少に伴い、ブラシボーダーへのフロリジン結合が90％減少することが示された。 フロリジンはSGLT1の特異的、非輸送的、競合的阻害剤である。
GGMの最も信頼できる診断法はH2呼気試験である（Fig.2）。 グルコースまたはガラクトース（2 g/kg）を経口投与すると、GGM患者では呼気中のH2が20ppmを大きく上回るが、対照群や果糖投与群ではそのような上昇はない。 GGMの小児は果糖を補充したミルクで「正常に」成長するが、成人になってもわずかティースプーン1杯（6g）のブドウ糖で症状が再発し、呼気H2検査は陽性のままである。 この病気はかなり稀です。
図2.1歳のグルコース・ガラクトース吸収異常症（GGM）患者（血族23、文献10）と正常な3歳の妹のH2呼気試験。 グルコース2g/kgとフルクトース1g/kgの2回試験を行い、30分毎に呼気中のH2濃度をモニターした。 点線は正常者の呼気H2濃度の最大値を示す（M. Martı́n, unpublished observations）。 ppm, Parts/million.
1987年に我々が「発現クローニング」という新しい戦略でウサギNa+-グルコース共輸送体クローンを作成し、腸の糖吸収に関する生理・病理生理学が発展しました。 この成功は、TurkとHedigerによるヒトNa+-グルコース共輸送体のクローニング（4）と、Turkらによる遺伝病GGMを引き起こす最初の輸送体の突然変異の同定（20）へとすぐに引き継がれることとなった。 我々は、GGMと診断された2人の姉妹から腸の生検を行い、いとこである両親から血液サンプルを採取した。 Turkら（20）は、それぞれの姉妹のSGLT1 cDNAにホモ接合性のミスセンス変異（Asp28Asn）を同定し、それぞれの親がこの変異のキャリアであることを見出し、卵子発現アッセイを用いて実際にこの変異がNa+-グルコース共輸送を完全に停止させることを証明した。 同じ血族において、その後2人の胎児に対して出生前スクリーニングが行われ、1人（プロバンドの兄弟）はAsp28Asn変異の保因者であることがわかり、もう1人（いとこ）は正常であることが判明した。 両者とも食事制限なしで成功し、少なくとも2年間は無症状であった(11)。
GGM を持つ子供の粘膜生検サンプルを得ることが困難なため、当初はさらなる進展は妨げられたが、Turk ら (21) がヒト SGLT1 遺伝子全体のマッピングに成功した。 この遺伝子は大きく、15個のエキソンが72kbのDNAに分散している。 エクソンとその近傍領域の配列が決定されると、少量の血液サンプルから得たゲノムDNAを用いて患者の突然変異をスクリーニングする一本鎖構造多型アッセイが開発された。 この方法では、15個のエクソンとそのイントロン-エクソン結合部をPCRで増幅し、変性させたPCR産物をゲル電気泳動して、変異を持つエクソンを特定することが行われた。 その後、異常のあるエクソンの塩基配列が決定された。 変異が糖輸送の欠陥に関与しているかどうかを決定するために、Na+-グルコース取り込みアッセイ用のXenopus laevis oocytesで変異体を発現させた。 Martı́n (Refs. 10, 12, and unpublished observations)は、この段階での大きな責任者であった。 この病気の原因となる突然変異は、調査した34人のGGM患者のうち33人で同定された。 17の血統の患者はホモ接合体の突然変異を持ち、別の10の血統の患者は複合ヘテロ接合体の突然変異を有していた。 これらの変異には22のミスセンス変異（図3参照）、4つのスプライスサイト変異、3つのナンセンス変異が含まれ、これらは重度に切断されたSGLT1タンパク質の産生をもたらすものであった。 34番目の患者の変異が検出されなかったのは、変異が遺伝子のプロモーター領域にあり、この領域からのDNAがスクリーニング手順に含まれていなかったからかもしれない。
図3.SGLT1の二次構造における23のGGMミスセンス変異の位置。 SGLT1には14個の膜貫通ヘリックスがあり、SGLT1は細菌と動物の膜輸送タンパク質の大きな遺伝子ファミリーの一員であることを示唆する証拠がある(20)。 Glycosylation treeはタンパク質の細胞外表面を示す。
輸送生理学者として、私はGGMミスセンス変異に興味を持ったのは、輸送に重要なタンパク質の残基を特定できる可能性があるからである。 そこで、ミスセンス変異が実際にどのようにNa+-sugar輸送の障害を引き起こすのかを明らかにすることにした。 このアプローチは、大部分がLostaoによって行われ（文献10および12参照）、X. laevisoocytesにおける変異タンパク質を発現させた後、生物物理学的および生化学的手法により、細胞内および細胞膜におけるタンパク質のレベルを決定した。 トランスポーターが細胞膜に挿入されている場合、私達（7）は輸送サイクルの部分的な反応を調べました。 最初に研究した 21 のミスセンス突然変異体では、主な欠陥は細胞内のトランスポ ーターのミスラフィッキングによるものであることがわかり、私達は最初がっかりし ていました。 ウェスタンブロットから、全ての変異体は野生型SGLTと同じか、それ以上のレベルで合成されていたのです。 しかし、卵子細胞膜の電荷測定（7）および凍結破砕電子顕微鏡（24）により、細胞膜の共トランスポーターの数が著しく減少していることが示された（10, 12）。 変異体のコアおよび複合糖質の程度で判断すると、SGLT1の細胞膜への輸送の欠陥は、小胞体とゴルジ体の間、あるいはゴルジ体と細胞膜の間で起こったと思われる。 変異体タンパク質のミスフォールディングがトランスポーターのミソーティングの主な原因である可能性がある(19)． Gln457Argの1例のみ、卵子細胞膜の変異タンパク質が正常レベルに近かった。
これらの卵子での実験はGGM患者の腸にどのような関連性があるのだろうか？ これに答えるために、我々はホモ接合体変異を持つ3人の患者の粘膜生検におけるSGLT1タンパク質の分布を免疫細胞化学的に調べた（未発表データ）。 3人全員において、卵母細胞における変異型タンパク質の分布は、患者の腸管細胞におけるSGLT1の分布と同じだった。2人ではタンパク質は細胞質内にあり、1人ではタンパク質は刷子縁にあった。 また、卵母細胞に関する我々の結果と、アメリカで最初のGGM患者からの生検のオートラジオグラフィー研究によって得られた結果との間には、一致が見られた(18)。 Stirlingとその共同研究者(18)は、患者のブラシボーダーへのフロリジンの結合が90％減少していることを見出したし、我々は卵母細胞形質膜に変異型SGLT1タンパク質（Cys355SerとLeu147Arg）を見いだせなかった(10)。 これらの研究は、少なくともこれらの4つのGGM変異体では、卵母細胞は腸細胞における変異タンパク質の挙動を再現することを示唆している。
残された大きな問題は、タンパク質全体に分布するミスセンス変異（図3）が、トランスポーターの細胞膜への輸送をいかに妨げるかである。 この疑問に対する答えは、細胞膜タンパク質の生合成を理解し、GGMの子供のための改善された治療法を考案する上で重要である。
ある血族のGGM突然変異、Gln457Argは、糖輸送のメカニズムに貴重な洞察を与えている。 Lostaoは卵子と患者の腸粘膜に発現したQ457R SGLT1の挙動を研究し（準備中）、このタンパク質が翻訳され、グリコシル化され、細胞膜に挿入されるが、糖を輸送できないことを見出した。 糖がない場合、変異体タンパク質はNa+漏出またはNa+ユニポート経路によってNa+を輸送し、これはフロリジンによってブロックされる。 グルコースもこのNa+輸送経路を遮断するため阻害剤となり、グルコースはQ457R SGLT1に結合するが輸送されないこと、すなわち変異が糖の転流障害をもたらすことが示された。 Panayotova-Heiermannら（15）は、SGLT1を通る糖の「孔」が、Q457残基を持つSGLT1のCOOH末端ドメインによって形成されていることを独自に証明した
これらの観察を利用するために、我々はQ457が糖輸送に果たす役割を調べた。 この研究では、システイン変異体Q457Cは、見かけのグルコースのミカエリス-メンテン定数（Km）が0.4から6 mMに増加する以外は、完全なNa+-グルコース輸送活性を保持していることがわかった。また、Q457Cに化学変異誘発剤として荷電または中性アルキル化試薬（メタンチオスルホン酸、MTS）のいずれかを添加すると糖輸送が完全にブロックできることが判明した。 しかし、アルキル化されたQ457Cタンパク質はグルコースと結合し、その解離定数はQ457C SGLT1による糖輸送の見かけのKmと非常に近いことから、この残基は糖結合部位の一部ではないことが予想された。 MTSによるQ457Cによる糖輸送の阻害は、コトランスポーターが外向きのNa+コンフォメーション、C2にあるときのみ起こった（図4）。 この試薬は，Na+非存在下，Na+とグルコース（またはフロリジン）存在下，あるいは脱分極した膜電位におけるNa+存在下では効果がなかった。 ローダミン標識Q457Cを用いた電圧ジャンプ実験でも、蛍光の時間経過とレベルが、共輸送体のコンフォメーションC2とC6の間の遷移に密接に追随することが示された（Fig.4）。 これらの結果は、共輸送体が少なくとも3つの異なるコンフォメーション（C6、C2、C3）で存在でき、リガンドと電圧によるタンパク質のコンフォメーション変化を通じてNa+輸送と糖輸送の結合が起こることを意味していると解釈した。
図4．SGLT1（7、16）の輸送特性を説明する1〜6の6種類のコンフォメーション状態を持つ代替アクセスモデル。 Q457C SGLT1のシステイン残基（C）は、外部のメタンチオスルホン酸試薬にアクセス可能な状態とアクセス不可能な状態の2つの形態であることが示されている（9）。
SGLT1のCOOH-末端ドメインにおける他の二つのGGMミスセンス変異、A468VとR499H（図3）を用いた予備研究は、残基をシステインで置換すると、卵子細胞膜への蛋白質の輸送が回復することを示している。 どちらのタンパク質も機能的であり、糖の輸送はMTS試薬によってブロックされる。 Q457Cの場合と同様に、これらの残基はタンパク質がC2コンフォメーションにあるときのみMTS試薬にアクセス可能である。 これらの結果は、膜貫通ヘリックス10-13（図3）が糖膜孔を形成しているという私の考えを支持するものである。
以上のように、SGLT1に関する分子生物学的研究は、ヒトSGLT1のcDNAのクローニングとその遺伝子のマッピングにつながり、Na+-グルコース共輸送の生理を調べ、GGMを研究するための強力な新しいツールを提供することに成功した。 GGMはSGLT1遺伝子の変異に起因することが確認されており、これらの変異の多くはSGLT1タンパク質のトランケートか、細胞内でのトランスポーターのミスラフィッキングのいずれかをもたらしている。 常染色体劣性遺伝性疾患であることから予想されるように、私的な変異がそれぞれの血族に疾患をもたらし、血族結婚の頻度が高い文化圏ではその頻度が増加する。 GGMはまれであるが、軽度のSGLT1変異を有する個体、あるいは1つの対立遺伝子に重度の変異を有する個体がより多く存在し、グルコースおよびガラクトースの吸収に障害がある可能性がある。 健常者である医学生の約10％がグルコースH2呼気試験で陽性となった(14)。 このような生理と疾病の接点は、糖吸収の病態生理の理解を深めるだけでなく、Na+と糖の細胞膜を介した輸送の連関の分子機構を研究する新しいアプローチを提供するものである。
これらのSGLT1およびGGM研究の進歩は、過去12年間のこの研究室の優秀なメンバーの素晴らしい貢献、GGM患者からの検体の提供を惜しまなかった世界中の医師、および国立糖尿病・消化器・腎疾患研究所からの助成金DK-19560、DK-44582、DK-44602の支援なしではあり得なかったであろう。
FOOTNOTES
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* 膜輸送の遺伝的障害に関する招待記事のシリーズの最初のものです