Abstract

この研究の目的は、新規Lactobacillus casei HD-010で発酵したタマネギ（Allium cepa L.）エキスの抗高脂血症と抗酸化能の調査を行うことであった。 一般に、タマネギ発酵エキスは、抗酸化活性（ORAC）、脂肪細胞分化抑制効果、ケルセチン含有量、抗高脂血症活性などで利用されています。 しかし、ApoE欠損マウスを用いた発酵タマネギエキスの経口投与による高脂血症に対する効果については、まだ報告されていない。 本研究では、タマネギ発酵エキスの高脂血症に対する作用を理解するために、ポジティブコントロールとしてベンザフィブラート（10 mg/kg, bw/day）を用いた。 血清は1週間ごとに採取し、低密度リポタンパク質（LDL）、高密度リポタンパク質（HDL）、トリグリセリド（TG）、コレステロールのレベル、3-ヒドロキシ-3-メチルグタリ-コアー（HMG-CoA）還元酵素活性、コレステロールエステル輸送タンパク質（CETP）活性を分析した。 発酵タマネギ処理群では、対照群と比較して、HDLレベルが有意に増加し、TGとLDLのレベルが有意に減少した。 また、HMG-CoA還元酵素の阻害活性は、100mg/kgの発酵タマネギ投与群で20％増加した。 CETP活性は、発酵タマネギ投与群では対照群に比べ有意に抑制されることが確認された。 これらの結果は、発酵タマネギが高脂血症に対する予防・治療効果を持つことを示唆している。 機能性食品として開発される可能性がある。 はじめに

近年、韓国を含むアジアでは、食品消費パターンが伝統的な発酵食品ベースの摂取（キムチ、納豆など）から脂肪を含む西洋風の食事（肉、脂肪など）へとかなり変化している。 欧米化された食事パターンは、肥満、高血圧、糖尿病、高脂血症のリスクを高めることが知られている。 高脂血症は心血管疾患のリスクファクターである。 高脂血症を予防するためには、高コレステロール血症をコントロールすることが重要である。 血中の中性脂肪値を下げることは、心血管疾患患者の治療の一つであり、特定の薬剤によりLDL受容体を誘導し、VLDL分泌を制限する。

高脂血症の症状を抑えるための薬剤には、HMG-CoA還元酵素阻害剤（スタチン）、PPAR-α活性剤（フィブラート）、CETP阻害剤、胆汁酸隔離剤、ACAT阻害剤があるが、これらは、高脂肪の症状を抑える。 しかし、これらの薬物による長期治療には副作用がある。

血中のコレステロール濃度を下げることは、心血管関連疾患のリスクを減らすために、機能性食品や医薬品開発における重要な研究課題です。 植物や生物から得られる天然成分は、病気の発生リスクを低減するための潜在的な候補となります。 タマネギ（Allium cepa L.）は、血中コレステロール値を低下させるために使用されてきた。 アジアでは、その解熱作用、抗寄生虫作用、解毒作用、腸の抗炎症作用により、伝統的に薬として使用されてきた。 タマネギの主な成分は、フラボノイド（ケルセチン、クエルシトリン、ルチン）、硫黄化合物（アリルプロピルジスルフィド、ジアリルジスルフィド）で、健康増進作用がある。 また、コレステロールを減らす方法として、乳酸菌を使った発酵があります。 乳酸菌は、コレステロールを減少させる効果があることが研究されています。 Klaverらは、乳酸菌が胆汁酸を脱共役し、コレステロールの働きを抑制することを報告している。 しかし、ApoE欠損マウスを用いた発酵タマネギエキスの経口投与による高脂血症に対する効果については、まだ報告されていない。 そこで、本研究では、新規乳酸菌Lactobacillus casei HD-010を用いた発酵タマネギ（Allium cepa L.）の脂質代謝における抗高脂血症および抗酸化能に着目した。 材料と方法

2.1. 菌株の選択と培養条件

発酵タマネギから10菌株を同定し、主な菌株はLactobacillus casei HD-010であった（表1）。 陽性対照としてKorean Collection for Type CulturesのL. casei KCTC 2180を使用した。 同定されたL. casei HD-010株を30℃で10日間培養し、タマネギエキスを発酵させた。 タマネギ抽出物は、二重蒸留水で3回洗浄した清浄なタマネギのミンチを使用して調製した。 発酵には、121℃、15分間オートクレーブしたタマネギエキスを用いた。 菌株同定用培地は5.5%MRS broth（Difco, France）に2.0%寒天（Difco, France）を加えて調製した。 液体培地は、2.0%寒天を含まない菌株同定用培地として調製した。

2.2. 発酵タマネギエキスの調製

30リットル発酵槽（Biostat C Plus, Sartorius, Sweden）を用い、無菌状態でタマネギエキス100％を用いてタマネギエキス発酵を行った。 タマネギエキスを冷却後、37℃で24時間振とう（200rpm）培養した1% HD-010を発酵槽に接種し、37℃で10日間振とう（25rpm）培養した。 発酵したタマネギ抽出物をフィルター（孔径0.2μm）でろ過した後、凍結乾燥（PVTFD20RS、Ilshin Lab. Co.、韓国）し、実験を行うまで-80℃に保存した。 陽性対照として、L. casei KCTC 2180を使用した。 L. casei HD-010と同じ方法で調製した。

2.3. 酸素ラジカル吸収能（ORAC）のアッセイ

発酵タマネギ、有機溶媒の層、画分、およびサブ画分の抗酸化能力をGillespieらによって記載されたORACアッセイを用いて決定した…………………………… 簡単に言うと、サンプルまたはTrolox（0、6.25、12.5、25、50、100μg/ml）をリン酸緩衝食塩水（75mmol/L、pH7.4、Thermofisher scientific, Waltham, MA, USA）と混合しました。 その後，β-フィコエリスリン（0.2 mmol/L）とラジカル発生剤としての2,2′-アゾビス（2-アミジノプロパン）ジヒドロクロライド（AAPH，200 mmol/L，Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan）を96ウェルプレートのウェルに添加し，ラジカル発生剤とした。 蛍光ELISAリーダー（VICTOR®, PerkinElmer, USA）を用いて2分おきに60分間蛍光を測定した（励起波長：535 nm, 発光波長：590 nm）。 AUC（曲線下面積）を求めるために用いた式は以下の通り：

ここで、f0は0分での最初の蛍光の読み、fiはi（1〜60）分での蛍光の読みである

2.4. 脂肪細胞の培養と分化

American Type Culture Collection (ATCC, USA)から3T3-L1細胞株を購入した。 3T3-L1前脂肪細胞細胞を96ウェルプレートに1×104個/ウェルの密度でプレーティングした。 そして、10％新生仔牛血清（Gibco, Invitrogen, USA）及び100 U/mlペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco, Invitrogen, USA）を添加したDulbeco’s Modified Eagle Media（DMEM, Gibco, Invitrogen, USA）培地で37℃、5％CO2で培養を行った。 次に、3T3-L1前脂肪細胞細胞を、10％牛胎児血清（FBS、Gibco）、10μg/mlインスリン（Sigma-Aldrich）、0.5mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX、Sigma-Aldrich）および1μMデキサメタゾン（Sigma-Aldrich）を含む分化培地（MDI）中で、培養した。 分化誘導剤（MDI、0.5 mM IBMX、1 μM デキサメタゾン、10 μg/ml インスリンを含む）で刺激してから2日後に、培地を10% FBSと10 μg/ml インスリンを含むDMEMに切り替えた。 2日後、培地を再び10%FBS/DMEMに変更した。 細胞は2日おきに10%FBS/DMEMで培養した。 完全な分化は8日目までに達成された。 分化誘導後4日目に3T3-L1細胞培養液にタマネギエキス試料を様々な濃度（6.25 ~ 100μg/ml）で添加した。

細胞内脂質量は、AdipoRed™ assay reagent（Cambrex, MA, USA）を用いて96穴プレートで測定された。 8日目に処理液を除去し、細胞を4%ホルムアルデヒド溶液で室温（25℃）で5時間固定した。 PBSで細胞を洗浄した後、各ウェルに200μlのPBSと5μlのAdipoRed試薬を添加した。 室温で10分間インキュベートした後、蛍光ELISAリーダー（VICTOR®, PerkinElmer, USA）を用いて、励起波長485 nm、発光波長535 nmの条件で測定した。 各群の値を用いて、脂肪細胞の分化を抑制する50％有効阻害濃度（EC50）を算出した。 陽性対照として、benzafibrateとsimvastatinを用いた。

2.5. L. casei HD-010

で発酵させたタマネギエキスの分離・分画

凍結乾燥したタマネギエキスを蒸留水に懸濁し、4種類の有機溶媒（n-ヘキサン、CH2Cl2、酢酸エチル、n-ブタノール）と残留H2Oで分画をした。 これらのフラクションを減圧濃縮し、凍結乾燥することで残留溶媒を除去した。 CH2Cl2層をHP-20、シリカゲル、RP-C18オープンカラムクロマトグラフィーに同一カラム条件（3.8×60cm、300g）で順次適用し、L. casei HD-010（LFAc）で発酵した玉葱から活性化合物を得た＜3351＞＜5557＞2.6. ケルセチン含有量

発酵タマネギ抽出物中のケルセチン含有量は、分析用HPLC（島津製作所CBM-20A Network LCシステム、LC-6ADポンプ、SPD-M20APDA検出器、SIL-10AFシリーズ自動液体サンプラー装備）により定量分析された。 Eclipse Plus-C18 カラム (Agilent, 3.0 x 100 mm, 0.35 μm) を用い，流速 1.0 ml/min，全実行時間 30 分，移動相 90% ACN + 0.02 M KH2PO4 (pH 2.0 with H3PO4), サンプルまたは STD の注入容量 20 μl，波長 372 nm で測定しました。 比較誘導体標準物質としてQuercetin（Q4951）を用いた（CAS No.117-39-5, Sigma-Aldrich, USA）

2.7. 動物実験

ApoE欠損オスマウス（5週齢）を韓国のセントラルラボラトリーアニマル株式会社から供給し、23±0.5℃、湿度55±7%、明暗周期（12時間：12時間）で飼育した。 すべての動物は少なくとも1週間馴化させた。 ケージに入れ、低脂肪、低コレステロールの対照食D12336 (Central Laboratory Animal Inc., Seoul, Korea) を与えた。

すべての動物実験は、Kyungpook National Universityの病原菌のないバリアゾーンで実施した。 本研究で使用したすべての手順は、Kyungpook National UniversityのAnimal Care and Use Committee（IACUC承認番号：KNU2012-136）により承認された。

対照群には高脂肪食を与えた。 陽性対照群には、ベンザフィブラート（10 mg/kg）を与えた。 タマネギ発酵エキスを0.5mlの生理食塩水で経口投与し、量を変えて3群に与えた（低用量、25mg/kg；中用量、50mg/kg；高用量、100mg/kg）。 生理食塩水単独群はネガティブコントロールとして使用した（N=10/群）。 本研究の動物実験デザインをFigure 1に示す（図1）。 脂質量測定

マウスから眼窩内静脈叢を利用した後眼窩洞出血法により1週間おきに6週間採血を行った。 血液サンプルは室温で30分間インキュベートした後、600gで10分間、4℃で遠心分離した。 血清サンプルを調製し、アッセイまで-80℃で保存した。 HMG-CoA還元酵素阻害活性およびCETP阻害活性は、最後の実験時点（週サンプル）に採取した血清サンプルを用いて測定した。 HMG-CoA還元酵素活性はHMG-CoA還元酵素アッセイキット（Sigma, USA）、CETP阻害活性はCETPアッセイキット（Biovision, USA）を用いてそれぞれ測定した。 血清中の総コレステロール（TC）、LDL-コレステロール（LDL-C）、HDL-コレステロール（HDL-C）、トリグリセリド（TG）の含有量はAsan kit（Asan medical company, Korea）とBeckman Coulter biochemical analyzerを用いて測定した

2.8. 統計解析

結果は、平均値±標準偏差（mean ± SD）で示した。 データの統計解析は、両側スチューデントのt検定を使用して決定した。

3.Results and Discussion

3.1. 発酵タマネギは抗酸化作用を示す

L. casei HD-010で発酵させたタマネギエキス（LFAc）の抗酸化作用をORACアッセイで検討した結果、LFAcは抗酸化作用を示すことが分かりました。 LFAcは陽性対照であるTroloxよりも高いORAC値を示しました（LFAc抽出物のORAC＝1.02）

L.カゼイHD-010で発酵させたタマネギ抽出物のどの画分に抗酸化成分が含まれているかを調べるため、さらに材料と方法の項にあるように4種類の有機溶剤を用いて抽出物を分離させました。 LFAc-EtOAc画分が最も高いORAC値（ORAC of LFAc-EtOAc = 1.12）を示し（図2）、L. casei HD-010で発酵させたタマネギエキスのEtOAc画分（LFAc）には抗酸化成分が含まれていることが示唆された。 この結果は、L, casei HD-010（LFAc）で発酵させたタマネギエキスが抗酸化活性を有することを示唆している。

3.2. 脂肪細胞分化抑制作用

L. casei HD-010を添加した発酵タマネギ（LFAc）は、生タマネギやオートクレーブ処理タマネギ（> 20%）と比較して脂肪細胞分化抑制作用が見られた。 LFAcの阻害効果はCH2Cl2層（> 45%）で特異的に観察された（図3）。 ポジティブコントロールとして、benzafibrateは分化に影響を与えなかった。 しかし、シンバスタチン処理では、90%以上の分化阻害が認められた。 したがって、LFAcはHMG-CoA還元酵素活性を阻害することにより、抑制機能を有する。

3.3. L. casei HD-010で発酵させたタマネギエキスのジクロロメタン層（LFAc）は脂肪細胞分化抑制作用と抗酸化作用を併せ持つ

LFAc中の生理活性誘導活性化合物を精製・同定するために、CH2Cl2層をいくつかの分離操作（HP-20、シリカゲル、RP-C18オープンカラム）に付すと、LFAcの脂肪細胞分化阻害作用と抗酸化作用は、LFAcの生理活性誘導活性に影響を与えた。 SLFAc-4画分をさらにRP-C18オープンカラムで単離した後、強い脂肪細胞分化抑制活性を有するHLFAc-30およびSLFAc-4画分を順次得た（日付不詳）

LFAc後の高脂血症抑制機能を調べるため、MC画分をHP-20、シリカゲル、RP-18オープンクロマトグラフィーに供したところ、高脂肪率抑制効果は認められなかった。 HP-20のLFAc-HP3画分、シリカゲルのLFAc-S4画分、C1のLFAc-C3に抗酸化作用と脂肪細胞分化抑制作用が認められた（表2）。

3.4. Quercetin Contents

薄層クロマトグラフィー（TLC）を用いて、生タマネギエキス（FO）、滅菌タマネギエキス（AO）、発酵タマネギエキス（LFAc）から成分を分離した。 そのパターンは試料間で差がなく、4つの主要スポットが認められた（データは示さず）。 LFAc-C4フラクションが最も優れた脂肪細胞分化抑制効果を示し、有効な単一フラクションが特定された。 LFAc-C4フラクションからは、タマネギの主要成分の一つであるケルセチンが同定された。 FO、AO、LFAc、LFAc_CH2Cl2についてHPLCで検討した。 これらの画分中のケルセチン含量は、FO, 3.90 ± 0.041 mg/ml; AO, 7.13 ± 0.009 mg/ml; LFAc, 2.89 ± 0.064 mg/ml; そして LFAc_CH2Cl2, 20.53 ± 0.304 mg/ml であった。 ケルセチンの含有量は、発酵手順によって変化しなかった。 しかし、プロバイオティクスによる発酵後、LFAc-CH2Cl2ではケルセチン含有量が約10倍に増加した（図4）。

3． 動物試験

3.5.1. 体重

発酵タマネギエキスの体重に対する効果は、高脂肪食を与えたマウスを使用して6週間試験しました。 発酵タマネギエキス給与群では、いずれも体重の有意な減少が確認されました。 タマネギに含まれる食物繊維、フラボノイド、硫黄成分は、高脂肪食単独群と比較して、効率的に体重を減少させた（データ示さず）。 この結果は、発酵タマネギエキスの経口投与は体重に直接影響を与えないことを示唆しており、他の研究とも一致している.

3.5.2. 血清脂質含有量測定

血清は6週間にわたり毎週採取し、LDL-C、HDL-C、TG、TC含有量の変化を評価した。 実験終了後、血清はHMG-CoA還元酵素およびCETP阻害効果を検査した。 発酵タマネギエキス給与群（低、中、高）では、5週目からLDL-C値の有意な減少が見られた。 また、中・高発酵タマネギエキス給与群では、体重の継続的な減少が認められた（表3）。 また、HDL-C値は、投与後1週目から6週目まで上昇した（表4）。 LSP-11上清投与群では、3週目と5週目にHDL-C値とLDL-C値にかなりの変化が見られた。 これらのデータは、発酵タマネギエキスがLactobacillus casei HD-010由来の二次代謝産物の機能に対する相乗効果をもたらす可能性を示唆している。

血清TGレベルはコントロールと比較してすべてのグループでわずかに減少していた。 しかし、その減少量は統計学的に有意なものではありませんでした。 特に、高発酵タマネギエキス給与群では、1週目、2週目、3週目、5週目にTG値の有意な減少が見られた（表5）。 TC値は、発酵タマネギエキス高含有飼料投与群で5週目から減少した（表6）。 しかし、ベンザフィブラートと乳酸菌上清を与えた陽性対照群では、対照群と比較して、TC値に有意な差は見られなかった。

ApoE欠損マウスモデルを用い、発酵タマネギ抽出物の脂質蓄積抑制効果、HMG-CoA還元酵素阻害効果、CETP阻害効果を評価しました。 HMG-CoA還元酵素は、コレステロールの合成に関与している。 タマネギ発酵エキス投与により、HMG-CoA還元酵素は減少した。 しかし、その減少量は統計的に有意ではなかった（図5）。 CETPタンパク質は、HDLとLDLを体内に入れるためのキャリアとして働き、HMG-CoA還元酵素は、コレステロールの合成に関与している。 図5に示すように、CETP活性とHMG-CoA還元酵素は、発酵タマネギエキス投与後に有意に増加しました（図5）。 これらのデータは、発酵タマネギエキスがCETP活性の阻害を通じて効率的に腸の脂肪吸着をブロックできることを示唆している。

(a)

(b)

(a)
(b)

Figure 5

L.を用いた発酵オニオンの影響。 caseiHD-010がApoE欠損マウスの6週間後の血清CETPおよびHMG- CoA還元酵素活性に及ぼす影響。 データは平均値±SDで示した（1群10匹、独立した3回の実験を行った）。 未処理値と処理値の間の統計的有意性は、両側スチューデントのt検定により決定し、p値で示した；p値＜2763＞0.05およびp値＜2763＞0.001(対コントロール群); #p value < 0.05 and ##p value < 0.001 (対 L. casei KCTC 2180 and benzafibrate treated group).

Hyperlipidemia is an important issue in healthcare.HYPERLIPDISM は、高脂血症は医療における重要な問題です。 多くの重篤な心血管疾患に関与しています。 高脂血症は高血圧、糖尿病、肥満の原因となることが多くの実験や臨床研究で示されています。

多くの研究で、タマネギの成分や乳酸菌が血液中の脂質含有量を低下させることが報告されています。 タマネギは伝統的な薬としてよく知られています。 疫学的な調査も多く行われています。 アジア諸国では、硫化ジアリルやケルセチンを含むタマネギやニンニクが、心血管疾患の予防に使用されています。 タマネギは、約90％が水分、7〜8％が糖分（主に果糖）、微量のビタミンを含んでいる。 S-メチル-L-システインスルホキシドは、タマネギの成分の一つである。 血中脂質を減少させる効果がある。 ケルセチンは、動物実験において脂質の生成と合成を減少させる同様の効果を有している。 乳酸菌は、血中のコレステロール値を下げることができます。 多くの研究は、乳酸菌は胆汁酸の再吸収と細胞壁へのコレステロールの付着を抑制することができることを示している。 しかし、タマネギの発酵エキスは、まだ十分に研究されていない。 本研究では、タマネギ発酵に適した細菌を同定し、その血中脂質への影響を調べることを試みた。 その結果、タマネギ発酵エキスは経口投与により脂質代謝に影響を与えることが示唆された

4.結論

タマネギ発酵の抗高脂血症効果を担う主な活性物質はケルセチンであることがわかった。 この結果は、発酵タマネギが高脂血症に対する予防・治療効果を持つことを示唆している。

Data Availability

データはhttp://www.nodagi.netのオンラインレポジトリにリンクされています。

Conflicts of Interest

著者は、この記事の出版に関して利害の対立がないことを宣言します。

Authors’ Contributions

Woong-Suk Yang and Jin-Chul Kimはこの仕事に平等に貢献した。

Acknowledgements

本研究は一部Nodaji Co.から支援を受けた。 Ltd.（韓国、浦項市）の2012年度助成を受けました。