1.4.3.2 Mosquitoes

蚊はマラリア、デング熱、黄熱など人間の重大疾病のベクターであり、制御しようと努力しているものの、依然として深刻な問題であり続ける。 嗅覚、吸血、消化、生殖、免疫などに関わる新規の蚊の遺伝子を同定することは、蚊の個体数や蚊が媒介する病気を制御する新しい方法を開発するための基盤となることが期待されます（Chen et al.）。

三大蚊媒介生物のAnopheles gambiae、Aedes aegypti、Culex pipiens quinquefasciatus (http://www.vectorbase.org/) の最近のゲノム配列情報は、比較ゲノム学や転写プロファイリング研究に利用されており、新規蚊の大規模アレイの特定が可能になってきています。 RNAiは、蚊の生物学や蚊と病原体の相互作用の様々な分野で、遺伝子機能を特徴付けるためのツールとして急速に普及している（例えば、Fragkoudis et al.、2009年）。 その結果、アエギ類（A. aegypti, Armigeres subalbtus and C. pipiens）やアノフェリン類（A. gambiae and Anopheles stephensi）を含むこの生物群における非常に多くの機能的RNAiアッセイが発表されるに至っている。 しかし、これらの研究のほとんどは、デング熱や黄熱病の主な媒介者であるエジプト人と、アフリカのマラリア媒介者であるガンビア人の2種にのみ焦点を当てている（表1.1）。

これらの研究では、成蚊の胸部にdsRNAをマイクロインジェクションした後、摂食、病原体、臭気物質、殺虫剤、ストレス条件での挑戦を行い、その後蚊を調べ、嗅覚、摂食、消化・代謝、ストレス、解毒、クチクラ形成、繁殖、免疫、休止調節など研究対象の生理学的プロセスに対する標的遺伝子サイレンシングの表現形質効果を分析するという典型的な実験戦略であった。 以下では、蚊のRNAiに関する代表的な研究を紹介する。

嗅覚は、摂食、宿主の選択、仲間の位置・選択、産卵場所など、成虫と幼虫の幅広い蚊の行動を仲介している。 嗅覚は、におい分子による化学的刺激の知覚と、その刺激に対する特異的な反応の発達を伴う。 臭気物質は臭気物質結合タンパク質（OBP）によって捕捉され、嗅覚ニューロンの樹状膜にある臭気物質受容体（OR）に運ばれる。 近年、OBPとORの両遺伝子のRNAiターゲティングにより、嗅覚のメカニズムや特異性に関する貴重な情報が得られている（Biessmannら, 2010; Liuら, 2010; Pelletierら,,

温帯気候では、雌の成虫は宿主を探す行動をとらず、膨大な脂肪を蓄え、卵巣の発達が停止することを特徴とする休眠期間、ダイアポーズで越冬する。 この休眠期間の制御を操作することで、例えば、休眠して宿主を求めない蚊を誘導することができる。 このことは、Denlinger博士の研究チームのいくつかの研究で例証されている。 特に最近、彼らはRNAiを用いてC. pipiensの休眠機構を調べ、休眠の制御にインスリン/FOXOシグナル経路が関与していることを証明した（Sim and Denlinger, 2008, 2009a）。 また、越冬する雌の脂肪蓄積にいくつかの脂肪酸合成酵素が関与していること（Sim and Denlinger, 2009b）、非休眠中の雌の卵胞形成にリボソーム蛋白質S3およびS2が関与すること（Kim and Denlinger, 2010; Kim et al, 2010）についても証拠を得ている。 マダニにおける状況と同様に、無自発性蚊は、卵の生産を含む生殖サイクルを開始するために、脊椎動物の宿主の血液を摂取することを必要とする。 蚊の脂肪体は、血液から得たアミノ酸を利用して、卵黄タンパク質前駆体、主にビテロジェニン（Vg）を合成し、ビテロジェネシスと呼ばれる過程を経て、卵黄を生成する。 Vgはその後、血液リンパに放出され、卵巣に取り込まれ、特定のVgRを介して発達中の卵母細胞に沈着する。

A. aegypti蚊において、Vg遺伝子発現は、Raikhel博士のチームによって長い一連の優雅な実験によって集中的に研究されており、彼らは逆機能ゲノム学のツールとしてRNAiを用いていた。 このチームは、Vg遺伝子の転写が、ステロイドホルモン20-ヒドロキシエクジソン（20E）カスケードと栄養AA/TORシグナルを含むいくつかの分子の複合入力によって厳密に制御されていることを証明した。 このセリン・スレオニンキナーゼは、AAシグナルの伝達を担い、翻訳イベントの活性化に必要なS6キナーゼのリン酸化を活性化する（Parkら、2006；RoyとRaikhel、2011）。 さらに、同じチームは、血液消化と卵の発達の両方においてmiR-27が正の調節因子として機能することを示すために、特定のアンタゴミールを注射することによって、RNAiによるmiR-27の枯渇を生じさせた。 実際、miR-27自体は、20EおよびAA/TOR経路によって制御されている（Bryant et al.、2010）。

蚊ベクターの自然免疫系は、病原体の認識、シグナルの増幅、調節、伝達を仲介するシグナル経路、および宿主からの病原体の除去を仲介するエフェクター機構の3機能カテゴリに関わる遺伝子からなる（Baton et al.） RNAiはそれ自体、蚊の主要な抗ウイルス免疫機構である。 RNAベースの抗ウイルス免疫では、ウイルスのdsRNAが蚊のDicerによって認識され、siRNAに処理される。 その後、これらのウイルス由来のsiRNAは、RNAiおよび関連するRNAサイレンシングエフェクター機構を通じて、特定の抗ウイルス免疫を誘導します（Ding, 2010）。 RNAiを用いた蚊の免疫遺伝子の機能解析については、数多くの論文が報告されています。 一般的な免疫機構およびエフェクターに関する研究では、パターン認識受容体、抗菌および抗真菌シグナル伝達経路分子、および他の細胞エフェクター機構に関与するタンパク質に焦点が当てられている（Dong et al. 蚊と病原体の界面における分子間相互作用は、病原体とベクターの両方の生存と発達を保証します。 そのため、病原体と蚊媒介生物の分子間相互作用を理解することは、新しい防除法の開発にとって重要である。 過去10年間、比較ゲノム解析、転写プロファイリング、RNAiを用いた機能解析などの様々なアプローチを用いて、病原体による免疫反応に関与する蚊の遺伝子の同定と機能解析を目的とした精力的な研究が展開されてきた（Baton et al.、2008）。 これらの研究は、主に A. gambiae-Plasmodium sp.と A. aegypti-Dengue virus 2 (DENV-2) という2つの蚊と病原体の関連に焦点を当てたものである。 アルボウイルス感染に対する蚊の自然免疫応答についてはFragkoudisら（2009）、マラリア原虫に対するものについてはBrown and Catteruccia（2006）およびBatonら（2008）により、RNAiアプローチを含めて詳細にレビューされている

これらのRNAiベースの研究のほとんどは、蚊のベクターにおいて病原体が発生するために必要な遺伝子よりも、蚊の免疫防御機構の遺伝子を標的としている。 RNAiのノックダウン対象となった蚊の抗マラリア遺伝子については、そのほとんどが、中腸侵入時のオキテの殺傷とメラニン化に関わるものである（Brown and Catteruccia, 2006; Baton et al.） ノックダウンの対象となった抗ウイルス蚊遺伝子に関しては、シグナル伝達経路の構成要素であるものもあれば、RNAiベースの抗ウイルス防御の一部を形成するものもある（Fragkoudis et al.、2009のレビュー）。 これらの著者らは、計算機的アプローチを用いて蚊のタンパク質相互作用ネットワークの最初のドラフトを作成し、4つの主要な機能カテゴリー（複製／転写／翻訳、免疫、輸送、代謝）に分類される714の推定DENV関連A. aegyptiタンパク質を同定した。 これらの推定されるDENV関連タンパク質のうち10個をランダムに選び、RNAiによる遺伝子サイレンシングで検証したところ、そのうちの5個で蚊の中腸におけるデングウイルス感染価が有意に減少した。

これらの結果は、RNAiが昆虫疾患ベクターの免疫系をハイスループットに特性評価するための強力なツールになり得るという考えを裏付けるものであり、したがって、蚊の集団、蚊内部の寄生虫および蚊媒介性疾患の新規制御方法の開発に向けて、蚊の潜在的標的の特定と特性評価に貢献するものである。

RNAiが蚊のアルボウイルスに対する主要な防御機構の一つであることが発見された後、この経路を抑制すると感染した蚊のウイルス量が増加することが報告されています（Sanchez-Vargas et al.）。 2009). Cirimotichら（2009）は、二本鎖RNAに結合し、おそらくRNAi経路での処理から保護するタンパク質を発現するように操作したシンドビスウイルスを用い、それによってRNAiサプレッサーとして機能するようにした。 このウイルスは、感染した蚊の体内で通常よりもはるかに多くのウイルス粒子を生成し、さまざまな種類の蚊（ヒトスジシマカ、イエネコ、イエカ）に致死的であることがわかった。 この方法は、新しい遺伝学に基づく開発の一例であり、蚊の制御のための「集団抑制」戦略に役立つ可能性があります（Alphey, 2009）。

逆の目的、つまり、ウイルス抵抗性の蚊を得るためにRNAiベースの抗ウイルス性蚊の免疫を人工的に高めることも開発されています。 抗ウイルスRNAiは、ウイルスの断片に対応するヘアピンRNAを発現させることによって、トランスジェニックアエジプト蚊にDENVに対する耐性を付与するために使用されている（Franz et al.） 組織や時間に特異的なプロモーターを用いることで、ヘアピンRNAの発現を中腸（最初に感染する細胞）に限定することができ、また血液摂取後にのみ発現させることができるため、長いヘアピンRNAの恒常的発現から生じる蚊の体力への潜在的問題を最小化することができる。 このようなトランスジェニック抵抗性蚊を用いた蚊防除の「集団置換」戦略の利点と問題点については、Alphey (2009)に記載がある。