Discussion

人間の微生物叢は1000以上の異なる細菌種からなり、栄養供給の促進、病原体の定着防止、粘膜免疫の形成と維持など人間の健康に大きな役割を担っています。 最近、腸内細菌は宿主と共生関係にあることが認識されている。この大きな細菌群の中で、LAB（すなわち乳酸菌とビフィズス菌）を含むプロバイオティクスサプリメントは、下痢や炎症性腸疾患の予防や尿路性器感染症の予防など、人間の健康に対して様々な有益性を有すると主張されてきた。 しかし、特定の菌種や菌株がヒトの健康や疾病に果たす生化学的な役割に関する知見は非常に限られている。 本研究では、硝酸塩を多く含む食事と消化管粘膜表面の酸素濃度に適合したin vitro条件下で、ヒト腸管に定着する一般細菌種における硝酸塩還元経路の理解を深めることを目的とした。 その結果、以下のことが明らかになりました。 1) 通性嫌気性菌である大腸菌は、硝酸塩を亜硝酸塩に変換し、その後アンモニアに変換して培養液中に徐々に蓄積する。2) 発酵菌である L.plantarum を外来ヘムおよびビタミン K2 存在下で培養すると、同様のプロセスを行う。3) 大腸菌酵素は嫌気条件下でのみ亜硝酸から有意な NO を生成する。

ほとんどの真核生物は、主に酸化的リン酸化によってエネルギーを得ており、ATP の形成のために O2 を呼吸しなければなりませんが、大腸菌 K12 株を含む多くの腸内細菌は、O2 が制限され、硝酸が豊富にある場合、代替電子受容体として NO3-を使用できます。 大腸菌は腸内細菌科の代表的な細菌で、腸内細菌叢のごく一部を構成していますが、特定の菌株が病気を引き起こすことがあるため、特に重要な細菌です。 また、最近、宿主の炎症の副産物として生成される硝酸塩が、大腸菌の呼吸中に利用され、発酵のみに依存する大腸に存在する微生物に勝る成長利益を与えることが明らかになった。 L. plantarumは安全なプロバイオティクスと考えられており、哺乳類の腸管や、硝酸塩の腸-唾液サイクルによってミリモルレベルまで蓄積することが知られている人間の唾液中に普通に存在し、循環する硝酸塩全体の約25%を占めている … この細菌は、LABファミリーの典型的な通性ヘテロ発酵経路を示すが、この種に特有の、推定上の硝酸塩還元酵素系（narGHJI）をコードする遺伝子が最近L. plantarum WCFS1ゲノムに同定され、このことは、硝酸塩を電子受容体として用いることができることを示唆している … L.plantarumの遺伝子解析は、L.plantarumが非常に多様で多彩な代謝能力を持つことを明らかにした。 一方、乳児消化管由来の微好気性嫌気性菌であるB.longum infantisは、高濃度でも硝酸塩を還元する能力を示さなかった。 ビフィズス菌は乳児の消化管内細菌の90％を占めており、今回の結果は、成人の細菌叢に通常見られる硝酸塩還元能を有する舌や腸の微生物叢が確立する前に、特に高濃度の亜硝酸を示すヒト母乳が亜硝酸塩の食事源となるという観測と一致するものである。

図1では、5 mM NO3-を含む大腸菌培養物が、硝酸塩を添加していない培養物に対して競争的成長優位性を持つことを示し、次に亜硝酸塩とアンモニアの生成に対する酸素と硝酸塩勾配の影響を決定した。 その結果、硝酸還元酵素の発現を誘導するためには、酸素濃度が4%以下でも約2.5mMのNO3-で十分であり、24時間後には大腸菌細胞内と培地中にかなりの量の亜硝酸が蓄積されることがわかった。 しかし、大腸菌K12株は3種類のモリブデン含有硝酸還元酵素を発現しており、タングステンは活性部位のモリブデン原子を置換することにより、これらの酵素を不活性化できることはよく知られている ……このような酵素活性の調節について、分子レベルでの詳細な解析はこの研究の範囲外である。 図1で報告した実験と同様に培養したものに300μMの酸化タングステンを添加すると、亜硝酸塩の形成がほぼ完全に停止することがわかった（データは示していない）。 従って、モリブデン依存性硝酸還元酵素が亜硝酸塩の形成の重要なステップを担っていると考えられる。 また、大腸菌は、他の多くの細菌種と同様に、金属-ニトロシル錯体の形成による亜硝酸毒性に弱く、亜硝酸膜トランスポーターと亜硝酸還元を仲介する他の酵素を協調的に誘導することによって、この毒性を最小限に抑えていることも重要なポイントである。 大腸菌の硝酸塩および亜硝酸塩還元酵素の遺伝子およびオペロンの制御と発現に関する完全な説明は、Stewart および Cole による優れた出版物で見つけることができます。 しかし、NOの酸化（主にオキシヘモグロビンとの反応）による硝酸塩の内因性産生は、1970年代後半に示され、最近ではeNOS欠損マウスを用いた研究で、食事からの摂取よりも一桁多いことが長い間認識されてきました。 図5は、細菌の呼吸性脱窒素、窒素酸化物のアンモニアへの還元、内因性L-アルギニン/NO合成酵素経路、非酵素的亜硝酸塩還元によるNOの生成との関連をまとめたもので、このうちL-アルギニン/NO合成酵素経路は、窒素酸化物のアンモニアへの還元に関与している。 脱窒過程（赤枠）では、亜硝酸塩、NO、亜酸化窒素を電子受容体とする4段階のエネルギー生成反応により、硝酸塩が窒素ガス（N2）に還元される。 最近、N2の生成につながる完全な脱窒経路がヒトの歯垢中に存在することが証明され、ヒトではまだ重要性が低いと考えられていますが、硝酸塩が存在する非常に低い酸素濃度下では重要な役割を果たす可能性があり、ヒト腸内でもN2の生成を否定できないのではないかと推測しています。 脱窒とアンモニアへの異化性硝酸還元（DNRA、青枠）は、最初の硝酸から亜硝酸への還元ステップを共有しており、いくつかのクラスの硝酸還元酵素がこの反応に関連している。 DNRAでは、第2段階は亜硝酸塩からアンモニアへの6電子の直接還元であり、これはエネルギーを供給しないが、通性嫌気性細菌ではかなり一般的な解毒プロセスである。 DNRA は哺乳類のルーメンにおける硝酸塩代謝の主要な経路であることが示唆されている。 この研究では、酸素濃度 4%以下で mM 硝酸塩存在下で増殖した大腸菌と乳酸菌の硝酸塩還元産物としてアンモニアを同定した

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Respiratory denitrification も中間生成物として小さいが適切な量の NO を生成でき、腸内の細菌の NO 産出に関与しています . このほか、亜硝酸塩の酸変換（緑枠）、NOS酵素によるL-アルギニンの酸化（茶色丸）などもNOを生成する経路として考えられています。 図4Cでは、亜硝酸塩の非酵素的不均化反応のプロトン依存性を調べ、細胞内または体液のpHが5.5より低い場合にのみ関連性が生じることを示しました。 また、大腸菌やL.plantarumの活性型NOS酵素の存在は否定されたが、腸管上皮細胞は内皮型と誘導型の両方のNOSアイソフォームを発現してNOを産生することが知られている。 興味深いことに、腸でのNO生成は、腸粘膜の細胞に豊富に存在し、抗菌作用の一部としてNOを生成するために亜硝酸塩を基質として使用することが示されているペルオキシダーゼの酵素プロセスによっても誘発される可能性があります

我々は、これらすべての異なる硝酸還元経路が共存して同時に発生すると考えていますが、特定の生理条件に応じて1つの代謝物のみが優位になる可能性が高いと考えられます。

細菌の硝酸塩還元によるNO生成の生理的意義

これらのイオンからのNO生成は、心血管、免疫、胃腸の機能に重要な有益な意味を持つという証拠が蓄積されているにもかかわらず、多くの研究において食餌性の硝酸および亜硝酸は依然として毒性物質の可能性として描かれている。 腸内では、NOは粘膜血流の調節、腸の運動性、粘液の厚さなど、いくつかの生理的な機能を果たしている。 また、NOの慢性的な過剰産生は、炎症性腸疾患と関連しており、様々な細菌種の増殖を抑制する可能性がある。 しかし、Sobkoらは、従来のラットとは対照的に、無菌ラットの腸内のNO濃度は極めて低く、正常な細菌叢を接種すると、観察されるNO生成量は10倍に増加することを示しました。

我々の実験では、酸素とプロトン濃度で、硝酸塩からNOへの特定の還元経路が決定されました。 図4Aに示した結果から、大腸菌は硝酸塩濃度が1 mM以上の嫌気条件下で、脱窒またはCorkerとPooleが提案したペリプラズムチトクロムc亜硝酸還元酵素（Nrf）を介して、酵素的なNO活性がある可能性があることが示された. しかし、このNOの生成は、2%の酸素では大幅に減少し、硝酸塩に依存しなくなる。 重要なことは、大腸菌が0.1 mM硝酸塩で24時間培養したときに、取るに足らない量のNOを生成したというSobkoらの報告と、我々のデータが一致していることである。 LABは乳酸の蓄積により培地が酸性化すると、相当量のNOを生成した。 培地を新鮮なLMRS（pH = 6.5）に交換すると、LABの亜硝酸塩をNOに変換する能力がほぼ完全に阻害されたが、大腸菌では阻害されなかった。 腸の pH 測定値は 5.7 から 7.5 の間であることから、生体内での亜硝酸塩の不均化反応は、おそらく NO 産生のごく一部かつ局地的なものであると考えられる。 逆に、この経路は胃の酸性環境（pH約3）で確立された現象である。

まとめると、腸粘膜に近接した腸内細菌が生成するNOは、上記の有益な効果を発揮するか、より高レベルでは、これらの機能を妨害する可能性があることが示唆された。

Physiological implications of bacterial ammonia formation for health

Colonic bacteria has known to produce ammonia from amino acid deamination or via urease, the hydrolysis of urea into carbon dioxide and ammonia since the seminal studies of Vince et al. 最近、Coleらは、大腸菌の亜硝酸塩還元による主な生成物はアンモニアであり、中性pHではわずか1％程度しかNOに還元されないことを報告した。 本研究で得られた結果は、少なくともある種の一般的な腸内細菌は、亜硝酸塩を主にNOではなくアンモニアに還元することを示唆している。 健常者では、通常の生理的条件下では、下部消化管で発生したアンモニアの大部分は体液中に排泄され、肝臓の肝細胞でアンモニアと二酸化炭素がカルバモイルリン酸に酵素的に変換され、「尿素サイクル」という一連の反応に入り、尿素が生成されて腎臓から排出されます（図5を参照）。 アンモニアの正常な血漿濃度は10-35μMであるが、アンモニアの産生が過剰になると、門脈血中アンモニアが肝臓をバイパスして高アンモニア血症になることがある。 血中のアンモニアは血液脳関門を自由に透過し、高濃度（>100μM）は中枢神経系に毒性を発揮し、脳症や最終的には昏睡に至ります。 肝硬変の患者は非常に頻繁に肝性脳症(HE)を発症する。 肝不全を伴わない高アンモニア性昏睡は、Klebsiella pneumonia などのウレアーゼ能力を有する微生物による敗血症に起因するとされてきた。 高アンモニア血症の古典的な治療法は、抗生物質治療（腸内のアンモニア生成細菌を殺すため）とラクチュロースやラクチトールのような非吸収性糖類の投与による全身アンモニアレベルの減少である。 ラクチュロースは大腸菌の働きにより、主に乳酸に、また少量のギ酸や酢酸に分解される。 この酸性化により、アンモニアから非吸収性のアンモニウムイオンが生成され、血漿中のアンモニウム濃度が低下する。 食事性硝酸塩が腸および血液中のアンモニア濃度にどのように寄与しているかは不明ですが、ラクチュロースの存在による大腸内容物の酸性化の増加が、既知の酸依存性メカニズムによって、微生物がアンモニアではなく亜硝酸塩をNOに変換することを促進するという代替仮説を提案します。

結論

30年以上にわたって、外因性硝酸塩の生物学的運命は、ヒトに摂取された硝酸塩量の約60%に相当する排泄された窒素含有化合物では説明することができなかった。 この結果は、硝酸塩が唾液、胃、小腸、大腸の細菌によって亜硝酸塩に変換され、さらにNO、アンモニア、尿素、あるいは窒素ガスなどの他の還元型窒素生体分子に変換されるという考えを支持するものです。 硝酸塩-亜硝酸塩還元によるアンモニアの生成量と、脱アミノ化や細菌のウレアーゼ活性といった他の重要なプロセスとの比較といった疑問は、動物やヒトでの詳細な代謝研究を必要とします。 腸管内腔での食事性硝酸塩の変換の生物学的意義は、まだ確立されていない。 しかしながら、心血管保護作用があることが知られている伝統的な日本食や地中海食は、一人当たりの平均硝酸塩摂取量が、典型的な西洋食（米国では約40-100mg/日に相当）の2-3倍である。 共生細菌と窒素酸化物代謝とヒトの健康との関連についてはさらなる研究が必要であるが、哺乳類における窒素代謝の生物学的経路は、数年前に想定されていたよりも複雑かつ重要であることは明らかである

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