RESULTS AND DISCUSSION
BRAFV600E変異により構成的にMAPK活性化しているメラノーマ細胞株A375に対して、MEK阻害剤U0126を25μM濃度で8時間処理し、ERKリン酸化抑制をもたらした（図1 a）． IL-6、IL-10、VEGFなどの免疫抑制性可溶性因子mRNAは、U0126処理により有意に減少した（図1 b）。一方、コントロールのDMSO処理では、IL-10とVEGF mRNAの生成に影響はなく、IL-6のmRNAレベルがわずかに増加しただけであった。 U0126 を 18 時間投与すると、タンパク質レベルでも IL-10、VEGF、IL-6 の産生が抑制されたことから、活性化 ERK は、これらの免疫抑制因子を産生することにより、メラノーマに対する局所免疫応答を抑制している可能性が示唆された（図 1c）。 また、U0126の処理濃度を10μMに下げても、ERKのリン酸化の抑制とIL-6、IL-10、VEGFの産生抑制が起こった（描かれていない）。 この試験中、A375細胞のU0126処理による顕著な細胞毒性作用は観察されなかった。 U0126 は MEK1/2 に加えて MEK5 も阻害することが知られているが、A375 細胞では MEK5 基質であるリン酸化 ERK5 が検出されなかったことから（図らずも）、U0126 処理で認められた効果には MEK1/2-ERK1/2 経路が関与していることが示唆された。 IL-10 と VEGF 産生に対する U0126 の抑制効果は、BRAFV600E 変異を有する他の 3 つのメラノーマ細胞株、624mel、888mel および 928mel でも実証されたが、有意な細胞毒性は認められなかった（図 1 d）。 これらのメラノーマ細胞株はIL-6を産生しないため、活性化MAPKシグナルはBRAFV600E+メラノーマ細胞株における免疫抑制因子IL-10とVEGFの産生に一般的に関与しているようである。
MEK阻害剤U0126でMAPKシグナルを阻害することにより、BRAFV600E変異によりMAPKが構成的に活性化したメラノーマ細胞株からの免疫抑制性可溶性因子IL-6、IL-10、VEGFの生産が減少する。 (a) BRAFV600E変異を有するメラノーマ細胞株A375melを25μM濃度のMEK阻害剤U0126で処理する前と2、4、6、8時間後にERK1/2のリン酸化の阻害をウェスタンブロット解析により検出した。 (b) A375細胞における免疫抑制性可溶性因子IL-6、IL-10およびVEGFのmRNA発現の抑制。 IL-6、IL-10、VEGFを含む様々な可溶性因子のmRNAを、U0126による処理前、処理後2、4、6、8時間後に定量RT-PCRにより測定した。 対照処置はDMSO溶液で行った。 各時点のmRNAレベルはGAPDH mRNAで正規化し、0時間のそれに対する相対値で示した。 (c) 25μMの濃度のU0126で18時間処理した後のA375細胞からのIL-6、IL-10およびVEGFタンパク質の産生が減少した。 発現は培養上清を用いた ELISA 法で検出した。 収穫時のU0126処理細胞とDMSO処理細胞の生存率の比率は77%であった。 サイトカイン産生量は、細胞数からコントロールのDMSO処理細胞の値で正規化した。 ウェスタンブロットにより、ERKのリン酸化が強く阻害されたが、STAT3タンパク質、またはSer727およびTyr705におけるそのリン酸化は阻害されなかった。 (d）25μMの濃度のU0126で18時間処理した後の、BRAFV600E変異を有する3つのメラノーマ細胞株、624mel、888mel、および928melからのIL-10およびVEGFの産生の減少、これは培養上清を用いたELISAによって検出された。 収穫時のU0126処理細胞DMSO処理細胞の生存率の比率は、624melで95%、888melで103%、928melで100%であった。 サイトカイン産生量は、細胞数からコントロールのDMSO処理細胞の値で正規化した。 ウェスタンブロットでは、ERKのリン酸化を強く抑制したが、STAT3タンパク質のリン酸化は抑制しなかった。 888mel と 928mel 細胞では、STAT3 の Ser727 リン酸化のわずかな減少が観察されたが、624mel 細胞では観察されな かった。 これらの結果は、同様の結果を得た3〜4回の独立した実験の代表である。
しかしながら、MAPKシグナル以外の経路を介したサイトカイン生産に対するU0126の非特異的効果は、888melおよび928melにおいてSTAT3リン酸化がわずかに減少していることが観察されていることから（図1 d）、これらの実験から完全に否定することができない。 IL-10、VEGF、IL-6 の産生における BRAFV600E 変異による活性化 MAPK の役割を確認するために、BRAFV600E 特異的ショートヘアピン RNA（shRNA）を発現するレンチウイルスを用いて、A375、 888mel および 624mel という 3 つのメラノーマセルラインに BRAFV600E 特異的 RNAi をトランスフェクションした（11）。 BRAFV600E 特異的 RNAi は，IL-10，VEGF，IL-6 の産生を有意に抑制し，ERK リン酸化を抑制した（図 2）． これらの結果は、U0126（図1）によるこれらの因子の阻害が、MAPK経路の特異的な阻害と相関していることを確認するものである。 これらの結果は、マウスマクロファージにおけるERK1/2誘導性のIL-10産生（12）およびBRAFV600E依存性の血管新生促進用VEGF産生（13）を示す最近の論文と一致する。
BRAFV600E変異を有する3つのメラノーマセルラインからの免疫抑制因子IL-6、IL-10およびVEGFの産生の減少BRAFV600E特異的RNAiによって、免疫抑制性因子を減少させた。 BRAFV600E変異を有する3つのメラノーマ細胞株A375mel，888mel，624melに，ホタルルシフェラーゼmRNA（GL3B；コントロール）またはBRAFV600E mRNA（BRAF#1′） のショートヘアピンRNAをコードするレンチウイルスベクターを50または100倍数で感染させた。 感染後5または6日目にタンパク質を抽出し、ウェスタンブロット解析を行った。 BRAFV600E 特異的 RNAi により，BRAF タンパク質の減少に伴う ERK1/2 のリン酸化の大幅な減少が観察され，BRAFV600E 特異的 RNAi により，ERK1/2 のリン酸化の大幅な減少が観察された． STAT3 タンパク質および STAT3 の Ser727 または Tyr705 でのリン酸化に有意な差は認められなかった． 888mel および 624mel 細胞では，BRAF RNAi により Ser727 のリン酸化がわずかに減少した． レンチウイルス感染後5または6日目に、メラノーマ細胞を1-2×106cells/2mlの密度で等量分注し、18時間後の培養上清をIL-6、IL-10、VEGFのELISAに供したところ、IL-6、IL-10、VEGFが検出された。 IL-6、IL-10、VEGFの大幅な減少が観察された。 STAT3シグナルが活性化されると、VEGFを含む様々な因子が産生され、癌からの免疫回避につながることが明らかにされている（8、9）ため、A375メラノーマ細胞株の免疫抑制因子産生に関するMAPK経路とSTAT3経路の関係について検討した。 BRAFV600E のみ、あるいは STAT3 のみを標的とした RNAi により、IL-6、IL-10、VEGF の産生が大きく阻害された（図 3 a）。 BRAF-MAPK 経路と STAT3 経路を同時に制限することによる明確な相加効果や相乗効果は観察されなかった（図 3 a）。 A375細胞におけるBRAFV600E RNAiは、STAT3のDNA結合活性（図3 b）、STAT3プロモーター活性（図3 c）、STAT3のSer727またはTyr705でのリン酸化（図2）を減少しなかったが、ERKはSTAT3のSer727でのリン酸化が可能であると報告されていた(14)。 しかし、STAT3のリン酸化はERK非依存的な経路で起こることもある（15）。 624mel 細胞では、Ser727 でリン酸化された STAT3 がわずかに減少したが、DNA 結合活性（図 3 b）および STAT3 プロモーター活性（図 3 c）は BRAFV600E RNAi によって影響を受けなかった（図 2）。 888mel細胞では、同様にSer727リン酸化の減少が見られたが、逆にBRAFV600E RNAi後、STAT3のDNA結合活性（図3 b）およびSTAT3プロモーター活性（図3 c）は共に減少した（図2）。 これらの結果は、STAT3転写活性の低下が、これらのメラノーマ細胞株におけるMAPKシグナルのダウンレギュレーションによる免疫抑制因子の抑制を生み出す主要なメカニズムではないことを示唆している。
BRAFV600E単独、STAT3単独、または両方のRNAiによってA375細胞のIL-6、IL-10およびVEGF産生の抑制が、STAT3のDNA結合活性およびプロモータ活性に大きな変化がないこと。 (a) BRAFV600E単独、STAT3単独、またはその両方に対するRNAiによるA375細胞のIL-6、IL-10、VEGF産生の顕著な阻害。 感染から 5 日または 6 日後に同数の細胞を 106 cells/2 ml の密度で分注し、18 時間後の培養上清を IL-6、VEGF および IL-10 の ELISA 測定に供した。 BRAFV600E特異的RNAiによるBRAFおよびリン酸化ERK1/2の減少、STAT3特異的RNAiによるSTAT3の減少は、ウェスタンブロット解析により確認した。 同様の結果を得た6つの独立した実験の代表的な結果1つを示す。 (b）メラノーマ細胞株において、BRAF RNAiによるMAPKシグナルの阻害によって、STAT3のDNA結合活性に有意な変化がないこと。 STAT3 DNA結合活性は、コントロールGL3BまたはBRAF#1′ shRNAベクター処理のいずれかのメラノーマ細胞株の核抽出物のEMSAによって調べた。 矢印で示した特異的なSTAT3バンドは、cold wild-type STAT3 DNA probe（wt）では消失したが、mutant STAT3 DNA probe（mt）では消失しない。 888mel細胞では、STAT3 DNA結合活性のわずかな低下のみが観察された。 (c) A375、624mel、および888mel細胞におけるSTAT3レポーターアッセイ。 コントロールまたはBRAF#1′shRNAベクター感染のいずれかの2〜4×105細胞を、Effectene Transfection Reagentを用いて0.4μg pSTAT3-TA-Luc および 0.4μg pRL-SV40 でトランスフェクションさせた。 トランスフェクションから24時間後に細胞を採取し、ホタルおよびレニラルシフェラーゼ活性を解析した。 各ホタルルシフェラーゼ活性は、レニラルシフェラーゼ活性で正規化した。 斜線のバーは平均値、エラーバーは標準偏差をそれぞれ示す。 3または4回の独立した実験のうち、1回の代表的な実験を示している。 STAT3駆動の転写は、A375及び624melではBRAF RNAi後に変化しなかったが、888melではわずかに減少した。
次に、A375培養物の上清中のMAPK及びSTAT3シグナルによって誘導される可溶性因子によるDCの成熟に及ぼす潜在的な影響について調べた。 A375メラノーマ培養細胞上清には、LPSなどのToll様受容体リガンドで刺激した際にヒト単球由来DC（MoDC）の成熟を阻害する可溶性因子が含まれています。 A375培養上清をMoDC培養に最終濃度10-20%で添加すると、MoDCにおけるIL-12やTNF-αなどの炎症性サイトカインの産生、CD1aやCD83の細胞表面分子が著しく減少したが、CD80、CD86、CD40、HLA-DRの産生は減少しなかった。 他の3つのメラノーマ細胞株からの上清は、MoDC培養物に添加されたとき、同じ結果をもたらした（描かれていない）。 メラノーマ細胞上清の抑制活性は、IL-6、IL-10、およびVEGFの産生に由来する。これらの因子に対する特異的抗体の添加により、A375培養上清の抑制活性が低下したからである（図4 a）。 STAT3が活性化したマウスB16メラノーマ細胞上清がMHCクラスIIとCD40の発現を抑制することに関する既報の結果と我々の観察との間の不一致は、腫瘍細胞または種が異なることによって説明されるかもしれない(8)。
DCからのLPS誘発IL-12およびTNF-α産生に対するBRAFV600E単独、STAT3単独、または両方のRNAiによる前処理によるA375メラノーマ培養上清の抑制活性の減少を示す。 (a) A375メラノーマ細胞の培養上清中のIL-6、IL-10、またはVEGFを中和すると、LPS刺激したヒトDCからのIL-12産生の阻害が回復した。 ヒトMoDCを、1μg/mlのIL-6、IL-10、VEGFまたはアイソタイプコントロールのモノクローナル抗体の存在下または非存在下で、A375上清と一緒に培養した。 培養上清中のIL-12産生は、100ng/mlのLPS刺激から24時間後にELISAで測定した。 (b）MACSを用いてPBMCからCD14+単球を分離し、RPMI1640、10％（vol／vol）FBS、100ng／ml GM-CSF、50ng／ml IL-4を含む培地で、図3で調製したA375mel細胞の培養上清を20％（vol／vol）添加、または添加せずに培養を行った。 (a) 培地、サイトカイン、培養上清の半分を2日ごとに交換し、培養5日目にLPSを100ng/ml添加した。 15時間後、培養上清を回収し、IL-12及びTNF-αのELISAに供した。
LPS処理MoDCのIL-12及びTNF-α産生に対するA375培養上清の抑制活性は、BRAFV600Eのみ、STAT3のみ、又はBRAFV600E及びSTAT3両方のいずれかを標的とするRNAiでA375細胞を前処理すると回復した（図4 B）。 STAT3 RNAiは、BRAFV600E RNAiよりもA375培養上清の抑制活性を低下させるように見えたが、その差は単にRNAi活性の違いによるものである可能性がある。 しかし、BRAF と STAT3 を同時に標的とする RNAi による相加効果や相乗効果は観察されず、DC の成熟に対する抑制因子の生成には、両方のシグナル伝達経路が不可欠であることが改めて示されたことは重要な点である。 STAT3 のドミナントネガティブ型を導入したマウス CT26 結腸癌細胞株上清による DC の活性化が報告されているが、本研究では DC の活性化は観察されなかった。 これは、BRAFとSTAT3の阻害が不完全であったこと、BRAF shRNAを導入したメラノーマ細胞では炎症性サイトカインの産生が増強されなかったこと、あるいは腫瘍細胞や種差によるものと考えられる。
以上のことから、共通のBRAFV600E変異によりMAPKが構成的に活性化しているメラノーマ細胞株において、STAT3経路とともにMAPKシグナル伝達が種々の免疫抑制因子産生に必須な役割を果たすことを初めて証明することができた。 このように、MAPK経路は、BRAFV600E変異のないメラノーマを含むいくつかの種類のがんで頻繁に活性化されているため、様々ながんの免疫回避を克服するための重要な分子標的である可能性があります（16、17）
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