The overall goal of this procedure is sequentially extract RNA and DNA from archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue cores. これは、RNAとDNAの両方を抽出する組織コアを採取するためのプロトコールである。 このプロトコルの主な利点は、組織ブロック内の正確に狙った領域からRNAとDNAの収量を向上させることです。

この手順は、主にアーカイブの前立腺癌組織で開発されました。 また、他の種類の保存組織にも適用することができる。

ほとんどの研究室では、組織を早く使い切り、サンプルに大きな不均質性を加える断面図を代わりに使用しているため、この方法の視覚的デモンストレーションは重要である。 まず顕微鏡のスライドを確認し、細いマジックで関心領域の輪郭を描く。 次に、顕微鏡スライドの関心領域をカバーするのに十分な大きさにパラフィンフィルムの一部をカットする。 細い点の永久マーカーで、組織全体と組織内の関心領域の輪郭を描きます。 次にスライドからフィルムを取り出し、対応する組織ブロックに移します。

組織全体の輪郭がブロック内で観察された組織の形と一致するように、フィルムを反転または回転させて向きを合わせます。 フィルムの断面をブロックの表面にしっかりと押し付け、ズレないようにします。

次に、0.6ミリパンチセットのレセプターパンチを、1ミリリットルの漂白剤を入れた1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに先端を沈め、パンチを上下に数回スライドさせて洗浄する。 70％エタノールの入ったチューブで洗浄を繰り返し、次に水で洗浄する。 今度は洗浄したパンチを関心領域に3ミリの深さまで押し込んで引き抜く。

コアをスタイラスでパンチから押し出して低結合のマイクロ遠心管に入れる。 組織コアの入ったマイクロチューブに1ミリリットルのキシレンを加え、10秒間激しくボルテックスする。 その後、50℃に設定したヒートブロックに3分間入れる。

インキュベーション後、室温で2分間、最高速度で遠心分離する。 遠心分離後、コアを氷上に5分間置き、ワックス状の残留物を固化させる。 ここで、メニスカス周辺に溜まったパラフィンを上澄み液とともにピペットチップで丁寧に取り除きます。

その後、キシレン処理を繰り返します。 パラフィン・キシレンミックスを除去した後、100%エタノール1ミリリットルを加え、10秒間激しくボルテックスする。 最大速度で2分間遠心分離した後、エタノールを注意深く捨てます。

ホモジナイズを始める前に、もう一度エタノール洗浄を繰り返します。 ホモジナイズする前に、脱パラフィンしたコアを700μlの100%エタノールに懸濁する。 組織コアのホモジナイズは、DNAとRNAの収量を最適化するために、モーター駆動の組織ホモジナイザーを使って、中程度の設定で細かい粒子に粉砕します。 次に、別々の15ミリリットルチューブに、約10ミリリットルの漂白剤、RNase中和溶液、70%エタノールを入れる。 サンプルのホモジナイズ後、ホモジナイザープローブを各洗浄液で順番に洗浄する。 プローブをティッシュで拭き、完全に乾燥させてから次のサンプルのホモジナイジングを行います。 ホモジナイズ後、100％エタノールでサンプル量を1ミリリットルにし、最高速度で15分間遠心分離します。 エタノールを注意深く吸引し、ペレットを約15～20分間風乾した後、プロテイナーゼK抽出を開始します。 ペレットを150マイクロリットルのプロテイナーゼK消化バッファに懸濁し、チューブをフリックしてペレットを緩める。

より高いDNA回収率を得るために、一晩のプロテイナーゼK消化を推奨する。 10μリットルの温度安定化プロティナーゼKを加え、フリックで混ぜる。 56℃で15分間、穏やかに攪拌しながらインキュベートします。

チューブを氷上で3分間、インキュベートします。 冷却後、チューブを最高速度で15分間遠心分離する。 次に、ペレットを乱すことなく、各上清をRNA精製用の新しいマイクロ遠心管に注意深く移します。

DNA抽出のための組織消化時間の延長を含む書面によるプロトコルの最適化手順を使用して、RNAとDNAを抽出します。 この方法で、古いホルマリン固定パラフィン包埋組織試料からRNAとDNAを回収することができます。 サンプル年齢が3年から14年の前立腺がんサンプルから核酸が共抽出された。

平均収量は、RNAが2, 270ナノグラム、DNAが820ナノグラムであった。 興味深いことに、組織サンプルの年齢と核酸の回収率との間には、有意な相関関係は見られませんでした。

このプロトコルで抽出したゲノムDNAの性能を実証するため、アーカイブの前立腺癌サンプルから得た重亜硫酸塩に変換したDNA抽出物を、メチル化特異的PCRで増幅した。 メチル化コントロールとしてALU反復要素を使用し、サンプル間の変動はほとんど見られなかった。 前立腺癌で高メチル化されることが知られている遺伝子であるGSTP1は、良性サンプルから抽出したDNAを用いた場合、methylation specific PCRによる増幅は検出されなかった。

進行性前立腺癌患者からのDNAサンプルは、低悪性前立腺癌細胞からのサンプルより低い検出可能なQPCRサイクル閾値を示し、進行性前立腺癌でGSTP1のメチル化が増加していることが明らかにされた。 この方法は、一度マスターすれば、RNAの場合は3〜4時間、DNAの場合は一晩消化した後、適切に実施すれば4時間で行うことができる。 この技術により、分子病理学の研究者は、さまざまな癌における診断用DNAおよびRNAバイオマーカーを探索できるようになるはずです。

このビデオを見た後には、保存組織ブロックの目的の領域を正確にマッピングし、DNAおよびRNAを抽出するための組織コアの準備方法を十分に理解できるはずです。