Abstract

BACKGROUND: ロバートソン転座は生殖リスクを伴い，関与する染色体や保有者の性により変動する． 着床前遺伝子診断（PGD）を受診した5組のカップルを報告する。 方法：PGDは、開裂期（3日目）胚の生検、遺伝子座特異的プローブを用いた蛍光in-situ hybridization（FISH）、および4日目胚移植を用いて行われた。 結果：カップル A（45,XX,der(14;21)(q10;q10)) は過去に 2 回妊娠しており、1 回は転座トリソミー 21 であった。 2回のPGDを経て単胎妊娠に成功した。 カップル B (45,XX,der(13;14)(q10;q10)) は 4 回流産しており、2 回は転座トリソミー 14 であった。 PGDの1サイクルで三つ子が誕生した。 カップル C (45,XX,der(13;14)(q10;q10)) は 4 年間不妊であり、2 サイクル不成功であった。 カップルD（45歳、XY、der(13;14)(q10;q10)）は乏精子症であった。 2回のPGDを経て単胎妊娠となった。 カップルE（45,XY,der(13;14)(q10;q10)）は精子数が正常範囲内で、異数性精子が少なかった。 従って、PGD は勧められなかった。 カオス的あるいはモザイク的な染色体構成を持つ胚の発生率が高いという証拠は見いだせなかった。 結論 妊娠可能なカップルの場合、慎重なリスク評価と遺伝カウンセリングを行った上で、PGDの実施を検討する必要がある。 転座のあるカップルが不妊のために受胎補助を必要とする場合、生存可能な染色体異常のリスクが低い場合でも、PGDは不均衡のスクリーニングとして有用である。 最も多いのは非相同型染色体、すなわち2本の異なるD群染色体（13、14、15番）、2本の異なるG群染色体（21、22番）、あるいはD群染色体とG群染色体が関与するもので、一般に1,000人に1人の割合で見られます。 これらの染色体再配列は減数分裂で3価を形成し、その結果、染色体再配列に関与する一方の染色体が無効または無効な配偶子が生じ、その結果、関与する一方の染色体がトリソミーまたはモノソミーとなる接合子が生じる可能性があります。 モノソミーの接合体は生命に適合せず、ほとんどの転座トリソミーの受胎は第1トリメスターかそれ以前に起こると予想されますが、中には第2トリメスター以降、出産まで生存するものもあります。 このD/D転座はロバートソン型染色体全体の75%を占める(Gardner and Sutherland, 1996)。 この転座による染色体異常の可能性は、転座トリソミー13（パタウ症候群）であり、第2期出生前診断での発生リスクは<0.4％である（Boué and Gallano, 1984; Gardner and Sutherland, 1996）。 また、トリソミー救済に伴い、14番染色体の片親不知の可能性もあり、そのリスクは0.1-0.5％と推定される(Gardner and Sutherland, 1996)。 14番染色体転座トリソミーは、第1トリメスターの喪失をもたらすと予想される。 しかし、der(13;14)保有者の中には不妊症や自然流産を繰り返す人がいる。 その他のD/D Robertsonianは頻度が低く、具体的なリスクは明らかになっていないが、der(13;15)やder(14;15)はder(13;14)と同様のリスクが予想される（Gardner and Sutherland, 1996）。 このD/Gロバートソニアンの潜在的な生得的不均衡結果はダウン症候群をもたらす転座トリソミー21である。女性保因者の場合、第2期出生前診断での発生経験リスクは15%で、生得的トリソミー21のリスク10%と従来通りUPD14のリスクも若干である。 男性保因者の場合、転座トリソミーの第2トリメスターリスクは<0.5%であり（Boué and Gallano, 1984; Gardner and Sutherland, 1996）、これはおそらく21番染色体の余剰相同体を持つ精子に対して選択的に不利であるためであろう。

21番染色体を含む他のD/Gロバートソニアンは、der(14;21)と同様の生殖リスクを有すると予想されます；22番染色体を含むものは、22トリソミーが生存可能性が非常に限られているのでリスクが低くなっています。 しかし、転座トリソミーの場合の妊娠の終了は、一部のカップルにとって受け入れがたい選択肢であり、これらの転座のキャリアについては、体外受精または卵細胞質内精子注入法（ICSI）による妊娠補助と組み合わせた着床前遺伝子診断（PGD）への関心が高まっている。 蛍光in-situハイブリダイゼーション（FISH）は、X連鎖性疾患の性判定（Handyside and Delhanty, 1997; Kuo et al, 1998; Staessen et al, 1999; Pettigrew et al, 2000）に用いられ、一方のパートナーが染色体再配列を持っているカップルからの胚の状態を調べるために用いられている。 染色体再配列の PGD は、各相互転座またはロバートソン転座に特化したプローブのワークアップから始まり（Munné ら、1998a）、これにより正常胚と均衡型転座を有する胚を識別することが可能となった。 各染色体に特異的なサブテロメアプローブの開発により、 相互転座に対するより一般的なアプローチが可能になりました (Handyside et al., 1998; Scriven et al., 1998) (National Institutes of Health and Institute of Molecular Medicine Collaboration, 1996)。 この方法は、相互転座保持者の妊娠に成功したが (Van Assche et al., 1999; Munné et al., 2000; Scriven et al., 2000)、「正常」胚と「均衡」胚の識別を可能にしない。 染色体再配列PGDでは、胚移植あたり19%の妊娠率が報告されている(ESHRE PGD Consortium Steering Committee, 2000)

Robertsonian translocationのPGDは、世界中のいくつかのセンターで、極体生検の両方で成功している (Munné et al.., 2000) 。 1998a,b）、および6-10細胞期（受精後3日目）の胚から1個または2個の胚盤胞を取り出す胚盤胞生検（Escuderoら、2000；Munnéら、2000）により行われている。 しかし、いくつかのセンターでは、ロバートソニアン転座保持者の胚に高いレベルのモザイクとカオスを報告し（Connら、1998、1999）、妊娠成功率が低下しています。 これらの観察から、ロバートソニアン転座は、何らかの形で、誤接合や正常な胚発生の欠如を引き起こす可能性があることが示唆されています。 この論文では、PGDの可能性を探るロバートソニアンカップルの経験と、実施したサイクルの詳細を紹介し、これらの転座キャリアに異常胚が多いという以前の報告が、少なくとも部分的には偶発的である可能性を示すデータも含んでいます。

材料と方法

Karyotyping and cytogenetic work-up for PGD

Karyotyping by G-banded metaphase chromosome analysis of cultured peripheral blood lymphocytes were performed using standard techniques. メタフェースおよびインターフェースの核に対するFISH検査は、以下に述べるプローブの組み合わせと方法を用いた。 プローブが期待通りにハイブリダイズすることを確認するために、両方のパートナーを評価した。各パートナーから10個のメタフェースの広がりを調べ、200個のインターフェーズ核を採点した。 間期核のプローブシグナルパターンは、従来のスコアリング基準（Munnéら、1998b）を用いてスコアリングした。 プローブの組み合わせは、シグナルの離散性と輝度に関して定性的に評価し、定量的データは、各プローブの独立した効率と各アッセイの特異性を推定するために使用された。 英国で要求されるように、各プローブの組み合わせについて、PGD を実施するためのライセンスを Human Fertilisation and Embryology Authority (HFEA)から取得した。

精子FISH研究は、以下に記載するプローブの組み合わせおよび方法を用いて、10mmol／lジチオスレイトール（DTT）で脱凝縮した成熟精子頭部で実施した

Ovarian stimulation, embryo culture and biopsy

これらは以前に記載した通りである（Scriven et al, 2000). 簡単に言えば、ゴナドトロフィン放出ホルモンアゴニスト酢酸ブセレリン（Suprefact；Hoechst）経鼻による黄体期ダウンレギュレーションに続いて、組換えFSH（Gonal-F、Serono）を毎日225i.u.で卵巣刺激をした。 ヒト絨毛性ゴナドトロフィン（HCG；プロファシ、セローノ）は、少なくとも3つの卵胞の直径が>18mmになったときに投与された。 卵子回収はHCG投与後36時間後に超音波ガイド下穿刺で行った。 卵子と胚はIVFシーケンシャルメディア（Science Scandinavia, Gothenberg, Sweden）において、空気中5％CO2中の油下で培養した。 卵子の採取と一晩の受精にはIVF培地を使用した。 正常受精した胚は，1 日目に G1.2 マイクロドロップに，2 日目の昼間に G2.2 マイクロドロップに移し替え，一晩培養した。 3 日目に Ca/Mg フリー Scandinavian Embryo Biopsy Medium (Science Scandinavia) とゾーニング用の酸性化 Tyrode’s solution で減圧した後，胚の生検処置を行った． 生検前に胚珠の核の有無を評価し，各胚から明確な核を有する胚珠1個を同定し，除去した． 胚を洗浄し、翌日の胚移植までG2.2マイクロドロップに交換した。

Spreading of blastomere interphase nuclei

各単一胚をシラン処理スライド上の0.01N HCl溶液中の0.2％Tween 20の1-2μlドロップに移した。 核が存在することを確認するため，胚盤胞を展張中に実体顕微鏡で観察した． スライドを20分間自然乾燥させ、PBSで5分間洗浄し、エタノール系列で脱水した。

FISH

生検した胚珠を以下のようにプローブでハイブリダイズした。 カップルA: locus-specific indicator (LSI) 21 (SpectrumOrange; Vysis, Inc., USA) とビオチン化14qサブテロメアプローブ（非商用）; カップルB、C、D: QuintEssential 13（ジゴキシゲニン標識、Appligene Oncor Lifescreen）およびTelVysion 14q（SpectrumOrange; Vysis Inc.、米国）。 標的物質とプローブを75℃で5分間共変性させた後、37℃で最低14時間ハイブリダイズさせた。 結合していないプローブを除去するための厳しい洗浄は、2×標準クエン酸生理食塩水（SSC）中、70-72℃で5分間行った。 ビオチン化プローブはフルオレセインイソチオシアネート（FITC）-アビジン（Vector Labs, Burlingame, CA）で検出し、ジゴキシゲニン標識プローブはFITC-アンチ-ジゴキシゲニン（Boehringer Mannheim, UK）を用いて検出した。 4,6-diamino-2-phenyl-indole (DAPI)/Vectashield (Vector Labs) で対比染色し、83 000 Pinkelフィルターセットを装着したOlympus蛍光顕微鏡を用いて可視化した。 画像は、Quipsイメージングソフトウェア（Vysis、英国）を用いて作成した。

非転移胚は、4日目または5日目に分解して広げ、得られた核を上記と同じプローブミックスでハイブリッド化した。

FISH結果の分類

FISHエラー率は上記のように計算された。 生検した細胞は、公表されている採点基準（Munnéら、1998b）に従って、FISHが検査した各染色体に2つのシグナルを明確に示した場合、「正常／バランス」状態に割り当てられた。 フォローアップFISHが、FISHアッセイの限界（リンパ球ワークアップに基づく特異度の95％信頼区間（CI））内で均一な「正常／バランス」シグナルパターンを示した場合、全胚を「正常／バランス」ステータスに割り当てた。 例えば、FISHアッセイの特異度が88％である場合、12核中3核までが逸脱したシグナルパターンを示した場合、異常なシグナルパターンに対するもっともらしいメカニズム（例えば、第2の細胞系列を明確に示す）が発動されないと仮定すると、フォローアップ胚は「正常／バランス」状態に割り当てられることになる。

生検細胞と全胚は、核が「正常/バランス」シグナルパターンから明確かつ一貫した逸脱を示した場合、「アンバランス」ステータスが割り当てられた。

生検細胞は、シグナルパターンが明確な正常結果でない場合は「不確定」ステータスとなった。通常は2つのシグナルが近くに横たわるため、2つのシグナルとして、または1つの「分割」シグナルとしてスコア化できる。 得られた核の品質が悪く、ハイブリダイゼーションが不十分で、決定的な診断ができない場合、全胚に「inconclusive」ステータスが割り当てられた。

胚を他のカテゴリーに分類するために、均一なシグナルパターンを持つ核の割合が不十分な場合（すなわち、上記のように95％信頼区間の外側）、胚全体に「カオス」のステータスが割り当てられた。 この夫婦には表現型的に正常な子供が一人おり（核型は不明），以前の妊娠では転座トリソミー21（ダウン症）が見つかっていた。 この夫婦のFISH検査では、LSI 21プローブと14qプローブの効率はそれぞれ97.4％と90.7％であった。 アッセイの特異度は88.3％であった。 8131＞＜7656＞1サイクル目では11個の卵子が採取され、そのうち7個が正常に受精し、3日目に5個の胚が生検された。 このうち4個は生検した細胞で正常/バランスのとれたシグナルパターンを示し、4日目に最も良好な形態を示した3個を移植した。 その結果、妊娠は成立しなかった。 5個目の胚は＋14、＋21のシグナルパターンを示した。 移植されなかった胚と2個の異常受精胚は4日目に撒かれた。 追跡 FISH により、移植されなかった正常／平衡胚は診断を確認したが、5 番目の胚は混沌とした 3 倍体の相補体を示した。 結果は表Ⅰに詳述する。

2サイクル目では15個の卵子を採取し、10個が正常に受精し、3日目に9個の胚が生検された。 このうち、3個は正常/バランスのとれたシグナルパターンを示した。 をすべて移植し、単胎妊娠となった。 この夫婦は、妊娠 12 週に絨毛膜絨毛サンプリングを選択し、胎児は転座の均衡型であることが示された。 45,XX,der(14;21)(q10;q10). 妊娠38週目に表現型的に正常な女児が誕生した。 移植されなかった胚の生検診断では、+21、-21、+14、-14が各1個、結論の出ないものが2個であった。 胚拡散後の FISH 検査で 21 番染色体トリソミーと 21 番染色体モノソミーが確認されたが，14 番染色体異数性と診断された胚の残りの核は正常/バランス型染色体相補と一致した． また、生検診断が不確定となった胚のうち1つは正常／バランスと一致したが、もう1つは変性し、拡散後に1つの核しか見つからず、診断は得られなかった。 異常受精卵はモザイク3倍体であることが示された。

したがって、診断に至ることができたこのカップルの場合、異常受精卵を除くと、交互分離（正常／バランス）と一致する胚の割合は全体で77％で、隣接分離（転座トリソミーまたはモノソミー）と一致するのは15％であった。 正常・平衡胚のうち2個は生検で不平衡と診断されたが、これはおそらくFISH技術の誤りの結果である。 これらの結果は表Iに詳述する。

ケースB

34歳女性パートナーは核型45,XX,der(13;14)(q10；q10)で、4回の流産歴を呈し、そのうち2回は核型検査を受け14トリソミーと判明していた。 FISHワークアップの結果、QuintEssential 13プローブとTelVysion 14qプローブの効率は、それぞれ97.2％と91.0％であった。 特異度は 88.5％であった。 8131>

10個の卵子を採取し、そのうち8個は体外受精で正常に受精した。 3日目に8個の胚が生検され，そのうち5個は正常/バランスのとれたシグナルパターンを示した（表Ⅰ）。 これらのうち3個は移植され、その結果、3つ子を妊娠し、その後2人の男の子と1人の女の子が生まれたが、いずれも表現型的には正常で、転座の保因者であった。 残りの胚のうち、2個は生検で＋13と診断され、1個は＋14と診断された。 14 型トリソミーと 13 型トリソミーの 1 つは経過観察で確認され、3 番目の異常胚は混沌とした染色体補体であることが判明した。 2つの異常受精卵も広がった。1つは3倍体のモザイクで、もう1つはハプロイドであった。

したがって、胚の63％は交互分離に一致し、25％は隣接分離に一致した。 これらの結果は表Iに詳述する。

Case C

37歳の女性パートナーの核型は45,XX, der(13;14) (q10;q10) であった。 4年間避妊をしなかったが妊娠に至らなかった。 8131＞＜7656＞1周期目に6個の卵子を採取し、体外受精で2個を受精させた。 1個の胚は生検に適し，正常/バランス型と診断され移植された。 妊娠には至らなかった。 8131>

2周期目、5個の卵子を採取し、うち2個を顕微授精で受精させた。 いずれも生検に適した胚が得られ、正常/バランスと診断され移植された。

症例D

35歳男性パートナー（女性パートナーは34歳）は、核型45,XY, der(13;14)(q10;q10) で乏精子症（0.2-2×106/ml）を呈していました。 この夫婦は過去に妊娠に至ったことがなかった。 精子FISHの結果、14％の配偶子が13番染色体または14番染色体の異数性であることが判明した。 8131＞＜7656＞1周期目に5個の卵子が採取され，顕微授精の結果4個が正常に受精した。 3日目に4個の胚が生検され，そのうち3個は正常・均衡と診断され，2個が移植されたが，妊娠には至らなかった。 3個目の正常/バランス胚は拡散し，経過観察で正常/バランスであることが判明した． 4個目の胚は生検で結論が出ず、経過観察でモノソミー14と判明した。

2周期目に5個の卵子を採取し、顕微授精ですべて正常に受精した。 3日目に5個の胚を生検し、そのうち3個は正常/バランスと診断され、5日目に移植された。 移植されなかった2個の胚のうち，1個は+13，1個は-14と診断された． しかし、両ケースとも経過観察では結論が出ませんでした。 したがって、胚の67％は転座染色体の正常/バランス補完と一致した。 単胎妊娠となったため、夫婦は出生前診断を拒否した。 妊娠20週目の詳細な胎児異常スキャンでは、脳梁離断、神経管欠損、腹腔中隔心臓欠損を含む重大な胎児異常が示されました。 羊水穿刺の結果、胎児の核型は一次性トリソミー18であることが判明した。 この異常は転座とは無関係と思われるが、染色体間の影響は否定できない（Blanco et al., 2000）。

ケースE：

41歳の男性パートナー（女性パートナーは37歳）（核型45，XY，der（13；14）（q10；q10））は正常範囲内の精子をもっていた。 転座は偶発的な発見であり、夫婦の生殖能力は確立されていなかった。 精子検査の結果、1.5％の精子が13または14型染色体異常であった。この夫婦は、PGDをしなくても染色体正常の妊娠が成立する可能性が高いため、PGDは勧められなかった。 図1は、2つの異なる胚の生検とフォローアップの結果です。

考察

ここで述べた正常受精卵のうち、20％は転座の異常分離の結果であった。 これは出生前診断における理論的リスクよりもかなり高く、おそらく生体内ではほとんどの異常胚が妊娠に至らないからであろう。 移植前にロバートソニアンの不均衡な産物を持つ胚をスクリーニングすることで、妊娠が成功する可能性が高まると予想されます。 PGD後の継続的な妊娠率は、不妊症のために行われるIVF/ICSIと同程度であるため、PGDは不妊症の問題を抱えるロバートソン転座のカップルにとって、受胎補助に有用であると考えられています。 これは、ロバートソニアン転座の性質やそれに関連する経験的な生殖リスクとは無関係です。 特に13対14のロバートソン転座の場合、妊娠損失の再発歴が転座と関連しない場合があります。この関連性は、4件の流産のうち2件が14番トリソミーであることが示された上記ケースBのように、受胎産物の核型分析によってのみ立証することができます。 転座との関連性が確立されていないカップルにPGDを依頼する場合、転座の役割が不明な場合に、妊娠可能な女性を体外受精の対象とすることが適切かどうかを検討する必要があります。 抗リン脂質症候群のような他の要因の可能性を十分に調査し、それに応じてカップルにカウンセリングを行うべきです。

13;14ロバートソン転座の男性保因者の経験的生殖リスクは低いです。 転座染色体のプローブを用いた精子FISHで異数性のレベルを確認することができ、精子数が正常で異数性のレベルが低い場合は、ケースEのようにPGDは適応とならないかもしれない。 ケースDのように、乏精子症とロバートソン転座を有する男性では、不妊を克服するために顕微授精が必要となる場合がありますが、その場合は、上述のようにPGDが有用な補助手段となるでしょう。 1998, 1999). これらの著者らは、テストした胚のうち、転座染色体について正常または均衡していたのはわずか13％であることを見出した。 ここで報告するサイクルでは、異常受精胚を除くと、70％の胚が転座染色体について正常またはバランスがとれていた。 カオスになったのは 2 個（6%）だけであり，真のモザイクは異常受精した胚にのみ認められた（表 I）。 いくつかの胚は4倍体であったが，これはサンプリングした細胞における核分裂および/または細胞質分裂の失敗を示し，正常な観察とみなされる． このため，これらの胚はモザイクに分類されなかった． 我々の発見は、モザイクまたはカオティックと分類された胚の51％という公表された数字とは異なる。これらの高いレベルは、胚の培養条件を反映しているのかもしれない（Scrivenら、2000）。 ロバートソニアン転座は、開口期胚の細胞分裂に異常をきたすことはないと結論づけたが、一部のカップルは高い割合で染色体異常胚を産む可能性がある（Munnéら、1996；Delhantyら、1999）。

結論として、この論文は、ロバートソニアン転座が開裂異常の胚を生じさせやすいという主張を支持するものではありません。 したがって、PGDを検討することは可能であり、これらの染色体再配列の保有者に対して有効な戦略であることが示されている。 今回ご紹介したカップルが成功に至らなかったのは、転座とは関係なく、生殖能力に問題があったためと思われます。 私達は、このカップルが将来の周期で妊娠に成功することを期待しています。 不妊症の場合、たとえ染色体異常のリスクが低くても、PGD は不均衡のスクリーニングとして重要であると考えられます。 これらの転座を持つカップルのカウンセリングでは、カップルや家族内の他の保有者の過去の産科歴、流産や出生時の染色体異常の確立されたリスク数値などを考慮する必要があります。