Abstract

ナノバイオ技術の進歩とともに、植物による銀ナノ物質 (AgNP) 生成という環境にやさしいアプローチがバイオ医療への適用に魅力となってきています。 本研究では、Chlorophytum borivilianum L. (Safed musli)のカルス抽出物を新規還元剤源としてAgNPを生合成したことを報告するものである。 カルス抽出物をメタノールに溶かしたAgNO3溶液は、還元反応により黄色から褐色に変色した。 さらに、紫外可視分光法、X線回折法、原子間力顕微鏡法、フーリエ変換赤外分光法を用いて、AgNPsの特性を評価した。 紫外可視スペクトルは、450nm付近でAgNPsの表面プラズモン共鳴の特性を明らかにした。 X線回折パターンでは、銀が面心立方であることを示す典型的なピークが観測された。 AFM分析により、平均サイズ52.0 nmの球状でよく分散したAgNPsの存在が確認された。 さらに、FTIR 分析により、ナノ粒子を形成するための生物学的還元過程におけるカルス抽出物の役割の異なる植物成分の関与が確認され た。 AgNPは、カルス抽出物と比較して、試験した病原性微生物、すなわち緑膿菌、枯草菌、メチシリン耐性大腸菌、黄色ブドウ球菌、およびカンジダ・アルビカンスをより効率的に抑制した。 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay は、ヒト結腸腺癌細胞株 (HT-29) に対する AgNPs の細胞毒性を用量依存的に確認するものであった。 500 μg/mL AgNPs の高濃度では、24 時間後の細胞生存率はわずか 7% であり、IC50 値は 254 μg/mL であることが観察された。 したがって、これらのAgNPsは、近い将来、様々な生物医学的用途に使用できる多様な可能性を明確に裏付けている。 はじめに

現代社会の新たな科学分野として、ナノテクノロジーは人類に大きな利益をもたらしています。 ナノテクノロジーは、1～100 nmのナノサイズの材料を製造し利用することを目的としています。 ナノサイズの材料は、そのユニークな特徴から、薬物分子の送達、画像分析、バイオマーカー、高分子や病原体の生体検出など、さまざまな分野での応用が魅力的です。 特定の生物医学的用途のためのナノ材料の合成には、いくつかの種類の金属が使用されています。 銀（Ag）、金（Au）、二酸化チタン（TiO2）、酸化亜鉛（ZnO）、酸化銅（CuO）、酸化マグネシウム（MgO）、酸化カルシウム（CaO）、シリカ（Si）などが挙げられる。 これらのナノ構造は、強度、可塑性、耐久性、機能性など、ユニークな物理化学的および生物学的特性を示す。 そのため、エレクトロニクス、生物医学、生物工学など、さまざまな分野で広く応用されている。 銀には抗菌作用があるため、ここ数年、様々な抗菌剤の調製に広く用いられている。 今日、銀は銀ナノ粒子（AgNP）の合成に用いられ、医薬、食品、ヘルスケアなどの分野でさまざまな用途に使用されています。 これは、表面積と体積の比が大きいAgNPsがユニークな生物学的、電気的、熱的、光学的特性を有するためです。

AgNPsを合成する方法には、化学的、物理的、生物学的方法など、いくつかのアプローチがあります。 しかし、好ましい方法は、植物化合物または植物抽出物、微生物、またはそれらの生成物を含む生物学的ルートを使用することである。 これは主に、安全性、費用対効果、環境に優しいという側面からである。 一方、化学的・物理的な方法では、有害な化学物質や多大なエネルギー、高圧、高温を必要とする。 AgNP は、Leptadenia reticulata、Cassia didymobotrya、Andrographis paniculata、Prunus japonica、Talinum triangulare、Euphorbia antiquorum、Thymbra spicata、および Cleome viscosa など、異なる植物抽出物を使用して次々と製造されてきた。 また、近年では、植物カルスを原料としたAgNPsの合成も行われている。 例えば、Catharanthus roseus, Sesuvium portulacastrum, Taxus yunnanensis, Centella asiatica, Cucurbita maxima などから誘導したカルスが AgNPs の生合成に使用されている。 カルス培養は、野生植物の供給源不足の問題を軽減することができます。 9466>

Chlorophytum borivilianum L. (Safed musli) は、フェノール、サポニン、フラボノイド、アルカロイド、タンニン、ステロイド、トリテルペノイド、ビタミンなどの多くの生物活性成分を有する、貴重な薬用植物である。 慢性的な白斑、糖尿病、関節炎、高血圧、閉経遅延などの治療に効果がある。 サフェド・ムスリの栽培の問題点を克服するために、その生物活性化合物を得るために植物組織培養のアプローチが採用されている。 サフェド・ムスリのカルス培養が植物二次代謝産物の信頼できる供給源であることは、Charlらによって以前に証明されている。 さらに、彼らはサフェドムスクのカルス抽出物の抗菌・抗酸化活性についても報告している。 しかし、サフェドムスリやそのカルスを用いたAgNPの生合成については、これまで報告されていない。 そこで、本研究では、Safed musliのカルス抽出物を用いた生物学的手法によるAgNPの合成とその生物学的特性の評価を報告する。

2 材料と方法

2.1. Safed Musliのカルス抽出物の調製

Safed Musliのカルス培養を開始するために、Nakashaらによって説明された方法に従った。 簡単に説明すると、Safed musliのシュート芽を5 mg/L 2,4-dichlorophenoxy acetic acidを含むMurashige and Skoog固体培地に植え付け、4週間培養した後、収穫した。 カルス抽出物を調製するために、新鮮重量のカルス20gをメタノール100mLとともに粉砕し、約5分間煮沸した。 Whatman No.1濾紙を用い、抽出液を濾過し、4℃で保存した。 この抽出液は1週間以内にAgNPの調製に使用した。 AgNPの生合成

約10mLのカルス抽出物を、三角フラスコ（250mL）に含まれる90mLの1mM AgNO3（硝酸銀）溶液に挑戦した。 反応混合物は、シェーカー（150 rpm）上で光を当てずに室温に保った。 色の変化を5時間まで定期的に記録し、AgNPを室温で3ヶ月間保存し、安定性を確認した。 反応混合物を20,000rpmで15分間遠心分離し、生物学的に合成されたAgNPsを濃縮し、さらなる特性評価を行った

2.3. AgNPsの特性評価

2.3.1. UV-Visible Spectral Analysis

反応混合物の色形成の変化を目視で確認した。 インキュベーションの1、3、5時間後に溶液の約2mLを定期的に採取し、分光光度計（ELICO、インド）を用いて300〜600nmの紫外可視スペクトルで銀イオンの還元を測定した

2.3.2.。 X線回折（XRD）分析

スライドガラスに、AgNP溶液を1滴加えて塗布した。 その後、X線回折装置（XRD）、モデルXRD-6000、島津、日本、40 kVと30 mAで2θ天使でCu ka放射を使用して、生合成ナノ粒子の結晶性を記録するために分析された。 原子間力顕微鏡（AFM）

AFM（A.P.E. Research A100、イタリア）を用いて、AgNPsの形態的特徴を観察した。 まず、AgNPsを含む溶液を室温で15分間、超音波洗浄器を用いて超音波処理を行った。 その後、AgNP溶液を乾燥させてマイカベースのスライドグラス上に薄膜を形成し、これをAFM下で観察に使用した。 フーリエ変換赤外分光法（FTIR）分析

生物学的に合成したAgNPのFTIR分析は、島津製作所IR Prestige-21 FTIR装置の拡散反射モード（DRS-8000）により、パーキンエルマーFTIRスペクトル使用KBrペレットで実施した。 測定は全て400〜4000cm-1の範囲で行った。

2.4. 抗菌活性評価

生合成したAgNPsは、一般的なヒト病原性グラム陽性細菌株に対してディスク拡散法を用いて抗菌活性を評価した。 Bacillus subtilis B29 (ATCC 29737), Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) (ATCC700698) （グラム陽性）, Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442), Escherichia coli E266 （グラム陰性）、および真菌1種、 Candida albicans 90028を使用した。 すべての微生物株は，マレーシアのセルダンにある UPM バイオサイエンス研究所の分子生物医学研究所から調達した． すべての細菌株はMueller-Hinton Agar（MHA）培地で維持し、C. albicans 90028はPDA（potato dextrose agar）培地にて培養した。 抗菌活性の評価には，ディスクディフュージョンアッセイ法を採用した（若干の修正を加えた）． 各微生物の純粋培養液を、滅菌綿棒を使用して、別々のペトリ皿に均一に塗布した。 この培養液に、異なる濃度（100、200、300μg/mL）のAgNPsと葉のメタノール抽出物をあらかじめ塗布した滅菌ディスク（直径6mm）を置いた。 ジメチルスルホキシド（DMSO）（10 μg/μL）およびゲンタマイシン（10 μg/ディスク）は、すべての試験微生物に対するネガティブおよびポジティブコントロールとしてそれぞれ使用した。 各処理は5回反復し、実験は2回繰り返した。 全てのプレートを37℃で24時間インキュベートし、阻害域の出現（mm）を定規の助けを借りて記録した＜9466＞＜13＞2.5。 大腸癌細胞株HT-29に対する細胞毒性の評価＜748＞＜8285＞先に報告したように、結腸癌細胞株HT-29に対する真菌性AgNPsの細胞毒性効果を評価した 。 具体的には，ペニシリン（100 U/mL），ストレプトマイシン（100 g/mL），L-グルタミン（2 mM）およびウシ胎児血清（10%）を含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）で細胞を増殖させた． 96ウェルプレートの1ウェルへの接種には、約5×104個の細胞を使用した。 37℃に調整したCO2インキュベーターを用いて、48時間培養した。 細胞毒性を調べるために，生合成したAgNPs（10，20，40，80，120，160μg/mL）で処理し，48時間培養し，3-（4，5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2，5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）試験で細胞の生存率を評価した． まず、新鮮なMTT溶液（5 mg/mL）を調製し、各ウェルに約10 mLずつ分注した。 さらに、同条件で4時間まで培養を続けた。 マルチウェルELISAプレートリーダーを用い、570nmの吸光度を記録した。 得られた吸光度は、以下の所定の式を用いて細胞生存率に変換した：

2.6. 統計解析＜748＞＜8285＞すべての実験は3回複製し、3回繰り返した。 各実験から得られたデータは偏差(SD)で表した。 結果と考察

3.1. カルス形成とAgNPsの合成

生物学的手法によるAgNPsの合成は、優れた薬理学的意義を持つ安定で均一なAgNPsが得られることから、近年、重要性が増してきている。 本研究では、サフェドムスリのカルス抽出物を基質として、室温でAgNPsを合成した。 本研究では、2ヶ月後に形成された黄色く縮れたカルスを収穫した（図1）。

どうやら、この段階でのサフェド・ムスリのカリは、植物二次代謝産物を分泌するために成熟し、よく発達したものと考えられる。 そのため、2ヶ月後に収穫したカリーをAgNPsの合成プロセスに利用した。 一般に、ナノ粒子の生成と特徴は、植物種の溶媒抽出物に含まれる生理活性化合物によって異なる。 AgNO3溶液にサフェドムスリのメタノールカルス抽出物を作用させると、生還反応により黄色から薄茶色に変化した（図2）。 これは明らかにAgNPの生合成を示唆しており、AgNPの表面プラズモン共鳴振動の励起と相関している。 1時間以内にすぐに色の変化が観察され、5時間までの培養時間に応じて色の強さが増加した。 しかし，5時間以上のインキュベーションでは，色の変化は観察されなかった。 色の強さは、培養時間の増加とともに徐々に増加し、培養5時間後に最も高い状態を維持した。 これまで、植物抽出物からの AgNPs 生合成に関与する正確なメカニズムは、明確に理解されていない。 しかし、生合成に関与する可能性のあるいくつかのメカニズムが提案されている。 すなわち、植物抽出物中に含まれるフェノール、フラボノイド、フィトステロール、テルペノイド、有機酸、アルカロイド、アルコールなどの多様な植物性化合物とともに、細胞内酵素が銀イオンからAgNPを効率よく生成する可能性がある。 これまで、銀イオンを還元してAgNPsを形成するまでの培養時間は、植物抽出物中の植物性成分の含有量の違いにより、植物種によって異なることが報告されている。

3.2. AgNPsの特性評価

3.2.1. 紫外可視分光分析

紫外可視分光分析、XRD、AFM、FTIR分析を用いることにより、カルス抽出物を介したAgNPsのサイズ、形状、分散、表面積に関する情報を得ることができました。 UVスペクトルでは、450nm付近にシャープな吸光ピークが存在し、AgNPsの存在を示唆した（図3）。 これまでの報告によると、425-460 nmの紫外-可視吸収帯はAgNPsの表面プラズモン共鳴（SPR）を示している。 この SPR ピークは、カルス抽出物の生物学的還元剤とともに、AgNPs を形成し安定化させるためのキャッピングに関与している可能性がある。 ブロードなピークの存在は、球状のAgNPsの多分散性に相関していると考えられる。

3.2.2. XRD分析

XRD分析の回折ピークの観察により、生合成AgNPsの結晶性、化学組成の詳細を知ることができる。 サフェド・ムスリのカルス抽出物を用いて合成したAgNPsのXRDパターンの結果を図4に示す。 20°から70°の回折強度が記録された。 38.34°, 44.54°, 64.6° の 2θ に観測されたピークは、それぞれ銀の面心立方構造の (111), (200), (220) 面に相当する。 これらの結果は、粉末回折標準委員会の記録(JCPDS no. 04-0783)と同様である。 同様に、観察された他のマイナーなピークは、AgNP表面に吸着された結晶性有機化合物と相関している可能性がある。 同様の回折パターンは、植物源から合成されたAgNPsに関連する過去の知見によっても観察された。

Safed musliのカルス抽出物を用いた生合成AgNPのXRDパターン

3.2.3. AFM分析

Safedムスクのカルス抽出物から生合成したAgNPsのトポロジー的特徴を記録するためにAFM分析を行った。 その結果、球状のAgNPsが均一に分散して存在することが明らかになった（図5）。 AgNPs のサイズは 35.1～168.0 nm であり、平均サイズは 52.0 nm であった。 生合成されたAgNPsは、粗さが7.9 nm、二乗平均平方根粗さが14.6 nmであることがわかった（図5（a）および図5（b））。 これらの結果は、これまでに報告されているLeptadenia reticulata, Murraya koenigii, Centella asiatica, Cleome viscosa, and Coptidis rhizomaなどの異なる植物種から生合成したナノレベルの球状AgNPsと確認することができる。

(a)

(a)(b)
(a)

(b)
（a）
（b）

（b）

（a）

（b）

（b）

図5

Safed musliのカルス抽出物によって生合成されたAgNPsのAFM像。

3.2.4. FTIR分析

生合成されたAgNPsとSafed musliカルス抽出物中に存在する異なる植物性化合物の相互作用をFTIR分析により決定した。 これらの植物成分は、AgNP生合成の際に還元剤や安定化剤として機能することが推測される。 図 6 は、生合成された AgNP の FTIR スペクトルデータであり、4000-500 cm-1 領域に 14 の明瞭なピークがあることを示 している。 3437.86 cm-1のブロードなピークは、-O-H基と-N-H基の伸縮振動に対応する。 同様に、2920.59cm-1のピークは、-C-H基の結果である。 1623.72 cm-1 と 1376 cm-1 のバンドは、それぞれ C=C 基の伸縮振動と C-N 的アミン基または C-O 的フェノール基の存在のためと思われる。 波数1382.41は-CH2基に割り当てられる可能性がある。 1019.38のピークはC=O基の伸縮に起因する。 828.4, 671.13, 615.95 cm-1の3つの弱いバンドは、-O-H基とC-H基の屈曲振動に相当する。 同様の観測は、以前の研究者が他の植物由来AgNPsについて行ったものである。 さらに、これらの吸光ピークは、Safed musliのカルス抽出物に存在する多数の植物化学物質に起因するものと考えられる。 これを裏付けるように、Charlらによる以前の研究では、ガスクロマトグラフィー質量分析法を用いて、異なる植物構成要素の存在が確認されている。 全体として、FTIRデータは、AgNPsを安定化させるだけでなく、バイオリダクションのプロセスにおけるサフェド・ムスリのカルス抽出物の多機能性を示しています。

3.3. 抗菌活性の評価

AgNP は広い抗菌スペクトルを示すため、臨床応用に広く用いられている。 しかし、抗菌剤としての使用は、その副作用の問題を解決して初めて有効であり、応用が可能である。 そこで、我々はサフェドムスリのカルス抽出物から生合成したAgNPsのヒト病原体に対する抗菌活性を評価した。 その結果、AgNPは用量依存的に試験したすべての細菌株を効率的に阻害することが確認された（Table 1）。 興味深いことに、AgNPはカルスエキスと比較して、より高い阻害域を示した。 300μg/mL濃度において、C. albicans（mm）に対して最も高い阻害が観察され、B. subtilis（mm）およびE. coli（mm）がそれに続いた。 しかし、すべての微生物は 300 μg/mL の濃度で AgNPs によって阻害された。 300 mg/mL濃度のAgNPsでは、B. subtilis ()に対して最大の阻害活性が観察され、C. albicans ()とE. coli ()がそれに続いた。 これまで、植物由来のAgNPsによる抗菌作用のメカニズムについて、いくつかの可能性が示唆されている。 その結果、AgNPs は微生物の細胞壁を変性させ、外膜を不安定にし、細胞呼吸を阻害し、生合成を阻害し、プロトン起電力を破壊することが示唆された。 また、AgNPs の表面積と体積の比率が高いことが、抗菌活性に関与している。 本研究の結果は、サフェド・ムスリのカルス抽出物から合成されたAgNPsが、多くの人間の病気を治療するための抗菌剤として使用できることを明確に示している。

3.4. AgNPs against Cancer Cells

さらに、がん細胞株HT-29に対するAgNPsの活性をMTTアッセイを使用して実施した。 その結果を図7に表す。 AgNPsの濃度が0から500μg/mLまで増加すると、細胞生存率の割合が減少した。 これは、AgNPsが用量依存的な細胞阻害活性を示すことを明らかに示唆している。 さらに、24時間から48時間への曝露時間の増加により、細胞生存率が減少した。 24時間後、対照処理では100%の細胞生存率を記録したが、500μg/mLのAgNPsではわずか7%の細胞しか生存せず、さらに72時間後には2%に減少した。 これは、AgNPsの高い毒性効果を意味する。 生合成されたAgNPsは低用量では毒性を示さないが、高用量では非常に高い致死効果をもたらす。 同様に、以前の研究者は、用量依存的に植物由来のAgNPsの潜在的な細胞阻害作用を記録している。 AgNPs の IC50 値は、24 時間、48 時間、および 72 時間の処理後に、それぞれ 254、216、および 174 μg/mL と計算されました

以前の報告で、Safed musliのカルス抽出物は様々なクラスのファイトケミカルを有していると述べられています。 したがって、水酸基、カルボキシル基、アミノ基などの植物性化合物の反応性官能基は、銀イオンとカップリングして高い細胞毒性を発揮する。 また、銀イオンは反応性官能基とともに細胞構造と激しく相互作用し、細胞障害を引き起こすことが証明されています

さらに、銀イオンは必須酵素のスルフヒドリル基やリンを含有する塩基に対して強い親和性を持っています。 そのため、AgNPは核酸と効果的に相互作用し、ミトコンドリア呼吸鎖の破壊、活性酸素の生成促進、DNA複製や細胞分裂の阻害、アポトーシス促進などを通じてDNA損傷を引き起こす。 さらに、AgNPsの他の特徴、例えば、ナノレジーム性、球状、粒子表面なども抗がん作用に寄与している。 同様に、多様なバルク材料を用いて作製したナノ材料が、大腸がん細胞に対して細胞抑制活性を示すことが解明された。 具体的には、抗がん活性は主に植物抽出物の化学組成とAgNPsのサイズや形態的特徴などのナノ粒子の特性に起因していた。 結論

結論として、本研究はサフェドムスリカルス抽出物を用いたAgNPs生合成のための効率、コスト効果、および環境に優しいアプローチについて説明するものである。 その結果、35.1～168.0 nmの粒子径を持つ球状のAgNPsを合成することができた。 XRDパターンから、AgNPsはナノ結晶の形態であることが確認され、AFM観察から、AgNPsは球状であることが確認された。 FTIRスペクトルは、カルス抽出物中のファイトケミカルの存在を明らかにし、AgNPsの生合成と安定化に寄与していると考えられる。 さらに、生合成されたAgNPsが抗菌活性と抗癌活性を示すことから、抗菌剤などの治療用途や大腸癌の治療のためのナノドラッグの製造に利用できる可能性があることが示唆された。

Data Availability

本研究の結果を裏付けるために使用したデータは、論文内に含まれています。

Conflicts of Interest

著者は、この論文の発表に関して利害関係がないことを表明します。