Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and its management

Cancer is the life-threatening disease causing about 8 million died worldwide annual the year. 食道がんは、がん関連死亡原因の上位6位に位置し、毎年約50万人の死亡に寄与しています（GLOBOCAN 2012）。 食道がんは、組織型としてはESCCが最も多く、特にアジアやアフリカの低開発地域に多くみられます。 ESCC患者さんには、多剤併用療法が行われています。 切除可能な早期の患者さんでは腫瘍切除が行われ、一方、進行した患者さんでは外科的切除の前にまず化学療法/化学放射線療法を行い、腫瘍のダウンステージを行います。 この手術前のネオアジュバント治療は、化学療法/化学放射線に感受性のある患者のサブグループで優れた奏効を得ることができるが、それでも患者の約1/3は部分的で最適ではない奏効を示すに過ぎない。 化学療法/化学放射線療法が奏効した患者でも、その一部は治療期間の後半に耐性を獲得する可能性がある。 腫瘍が切除不能で、化学療法や放射線療法に抵抗性を示す患者さんでは、有効な治療法がないのが現状です。 現在の治療法では対応できない患者さんに、より多くの治療選択肢を提供するために、新しい治療法が提案され、その抗腫瘍効果が現在進行形で臨床試験で評価されています。 このように進化し、新たに登場した治療法をもってしても、疾患を完全に治癒させることは困難です。 前臨床研究における腫瘍異種移植動物モデルの使用

研究用腫瘍異種移植動物モデルの開発の主な目的は、基礎研究と臨床研究の橋渡しとin vitroモデルシステムの使用を補足することである。 腫瘍異種移植動物モデルは、in vivo環境における腫瘍形成のプロセスを研究するための、より洗練されたプラットフォームとなる。 このプラットフォームにより、ある種の癌遺伝子や癌抑制因子の関連するシグナル伝達経路や疾病メカニズムを明らかにすることで、腫瘍の発生に関与していることをより良く理解することができます。 さらに、これらのモデルの使用は、薬物毒性、薬物動態および薬力学に加えて、抗腫瘍効果を決定することにより、前臨床薬物反応評価のための研究ツールを提供することができる。 薬物反応評価以外にも、これらのモデルは、新しい腫瘍検出方法や試薬の有用性と実用性をテストするためのモデルシステムを提供することにより、生物医学的イメージング研究を促進することができる。

マウスは、ヒトと同等のゲノムサイズの存在、短い繁殖サイクル、大きな子サイズ、低い維持コストおよび操作の容易さなど、いくつかの重要な利点があり、腫瘍異種移植モデルとして最もよく使用されている動物です。 がん研究において、免疫不全を背景とする様々なマウス系統が使用されており、無胸腺ヌードマウス、SCIDマウス、NOD/SCIDマウス（免疫不全を追加したSCIDマウス）などがある。 これらの系統の中で、ほぼすべての免疫細胞（B細胞、T細胞、樹状細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞）が欠損しているNOD/SCIDマウスが最も免疫不全であり、次いでB細胞とT細胞を欠損したSCIDマウス、さらにT細胞を欠損したathymic nude mouseの順となっている . 免疫不全の程度が異なるため、研究目的に応じて使用する系統を検討する。 ヒト腫瘍細胞株の移植にはathymic nudeマウスやSCIDマウスが、ヒト腫瘍の移植にはSCIDマウスやNOD/SCIDマウスが、コストや系統の特徴を考慮すると好ましく使用される。

ESCC研究によく使われる腫瘍異種移植動物モデル

ESCC研究のための腫瘍異種移植動物モデルは、ESCCの細胞・異種移植片や患者の腫瘍を免疫不全動物に移植して開発されており、皮下、同所、患者由来腫瘍異種移植モデル（図1）の3つがある。 それぞれモデルの特徴（表1）、確立方法（表2）、前臨床での有用性（表3）の点で長所と短所があり、初期、中期、後期の研究において独自の立場にある。

皮下腫瘍異種移植モデル

皮下腫瘍異種移植モデルはESCC研究用の古典的動物モデルである。 このモデルは、免疫不全動物の皮下にESCC細胞/異種移植片を移植し、皮下腫瘍を発生させることによって確立される。 皮下腫瘍の形成手順は、ESCC細胞を針で注入するか、ESCC異種移植片を動物の皮下に直接移植するだけなので、技術的に簡単である。 皮下腫瘍の成長は、電子ノギスを用いて触知可能な腫瘍を測定することにより、非侵襲的に行うことができる。 このような腫瘍の樹立とモニタリングの技術的手順により、このモデルの再現性と有効性（時間とコストの両方）を維持することができる。 このような利点がある一方で、このモデルは臨床の状況を完全に表現しているわけではないため、一定の限界がある。 例えば、ほとんどのシナリオでは、均質なESCC細胞株が原料として使用されるため、このモデルは腫瘍の異質性を低下させている。 さらに、皮下腫瘍は本来の腫瘍微小環境では成長しないので、腫瘍-間質相互作用の研究には適さない。 このような長所と短所があるため、このモデルは主にESCCの腫瘍形成の生物学とメカニズムを研究するための初期研究に使用されている。

多くの報告により、ESCC関連分子の腫瘍特性および関連する疾患メカニズムの研究に使用することにより、皮下腫瘍異種移植モデルを初期研究に適用することの利点が明らかにされている。 ESCC腫瘍で発現量が低下するmicroRNA-340をEC9706 ESCC細胞で過剰発現させると、皮下腫瘍異種移植モデルでの増殖性が抑制されることが明らかになった。 このマイクロRNAのESCCに対する効果は、同じ研究でマイクロRNA-340の直接の標的として同定されたタンパク質転移酵素PSAT1に対する効果を介して、部分的に媒介されていた。 別の研究では、マトリックスメタロプロテアーゼMMP1を過剰発現させたKYSE-30 ESCC細胞から得た皮下腫瘍が、対照細胞と比較してより速く成長することが示された。 さらに、これらのMMP1過剰発現ESCC細胞は、転移能も示していた。 MMP1が腫瘍の進行と転移を促進する能力は、PI3KとAKTを含む腫瘍形成経路への刺激作用によるものであることが一致して明らかにされた。 また、別の報告では、皮下腫瘍異種移植モデルを用いて、CRABP2を過剰発現したEC109 ESCC細胞由来の皮下腫瘍の成長速度が対照実験グループと比較して遅いことを示し、細胞性レチノイン酸結合タンパク質2（CRABP2）が腫瘍抑制因子であることが明らかにされた . これらの研究は、ESCC関連分子およびESCCにおけるそれらの関連メカニズムの研究に対するこのモデルの有用性をまとめて示している。

腫瘍生物学研究のための皮下腫瘍異種移植モデルの使用とは別に、このモデルを使用して、新しい治療方法またはESCC治療のための化合物／薬剤の抗腫瘍効果を調査する試みがなされている。 ESCCの予後マーカーであるmicroRNA-375の発現を誘導する処理を皮下腫瘍担持マウスに行ったところ、対照実験と比較して実験終了時に小さな腫瘍サイズが得られました。 このモデルは、新しい治療法を検討するための日常的な使用とは別に、現在腎細胞癌患者に使用されているテムシロリムスのようなESCCに対抗する新しい化合物/薬剤の抗腫瘍効果を調べるために適用された。 このモデルは、抗腫瘍性試験だけでなく、被験物質の化学感作性試験にも応用することができます。 高麗人参から抽出した成分であるジンセノサイドRg3を皮下腫瘍担持動物に投与したところ、ESCC患者によく使われる2種類の化学療法剤であるパクリタキセルとシスプラチンに対するこの化合物の増感効果が証明された。 さらに最近、新規の酸素運搬体であるYQ23が、ESCC患者に用いられる従来の化学療法剤であるシスプラチンまたは5-フルオロウラシルを用いた治療計画において、化学療法抵抗性の皮下SLMT-1 ESCC異種移植片に選択的に化学感作効果を発揮し、化学療法感受性を有するHKESC-2 ESCC異種移植片には効果がないことが明らかにされました。 試験化合物/薬剤の単独またはESCCに使用される一般的な化学療法剤との併用による抗腫瘍効果を検討した上記の研究は、化合物/薬剤の試験における皮下腫瘍異種移植モデルの前臨床での有用性を強調しています。

まとめると、皮下腫瘍異種移植モデル、特にESCCに現在使用されている化学療法剤に対する感受性についてよく特徴付けられたモデルは、in vivo環境におけるESCCの腫瘍生物学および疾病メカニズムの研究および前臨床抗腫瘍効果試験を行うための貴重な研究ツールである（表3）。

Orthotopic tumor xenograft model

Orthotopic tumor xenograft modelは、ESCCの研究に用いられる代替動物癌モデルである。 このモデルは、免疫不全動物の食道にESCC細胞/異種移植片を移植し、同所性腫瘍を発生させることによって確立される。 同所腫瘍の樹立は、小動物の手術や麻酔を必要とするため、皮下腫瘍の樹立に比べ技術的に困難である。 ESCC細胞／異種移植片を動物の食道に移植するには、主に2つのアプローチが採用されており、それらは腫瘍を移植する部位で異なっている。 一つは食道上部に移植する方法、もう一つは食道下端の胃食道接合部付近の腹部で移植する方法です。 最近、食道上部と下部の腫瘍を同所移植した動物の生存率を比較したところ、腹部の腫瘍を移植した動物の方が生存率が高いことも報告しています。 同所腫瘍の樹立には時間と労力がかかりますが、このモデルは臨床と同様の正しい腫瘍微小環境での腫瘍増殖の研究に対応でき、腫瘍-間質相互作用の研究が可能です。 しかし、ESCC細胞株を腫瘍樹立のための材料として使用するため、皮下モデルと同様の制限を受ける。 このモデルのもう一つの大きな欠点は、腫瘍の成長をモニターするために、例えば、生物発光技術を用いたin vivoイメージングシステムなど、特殊なイメージング手法を用いる必要があることである。 これらの制限にもかかわらず、このモデルの長所は、中期から後期の研究で使用するための貴重な動物モデルである。

同所的腫瘍異種移植モデルは皮下モデルと比較して優れた利点を有するが、上記の制限によりその使用は依然として制限されている。 しかし、ESCCの腫瘍形成の研究や、前臨床試験での抗腫瘍性試験への応用を示す報告は増えてきている。 このモデルを用いて膜貫通型プロテアーゼDESC1の腫瘍抑制効果を明らかにしたところ、DESC1発現KYSE-150 ESCC細胞を用いた場合、対照細胞を用いた場合と比較して腫瘍増殖速度が遅くなることが観察された。 このモデルを用いて、腫瘍関連タンパク質キナーゼAKTの腫瘍表現型を調べた独自の研究では、AKTのノックダウンに関連する明らかな腫瘍抑制効果が見出され、同所腫瘍の成長速度の低下が容易に検出された。 このモデルは、腫瘍の成長を研究するために使用される以外に、腫瘍の浸潤のメカニズムを研究するために応用することができる。 包括的な研究では、T.T ESCC細胞から得た同所腫瘍と浸潤性のあるT.T-1 ESCC細胞の間で観察された浸潤パターンに基づいて、腫瘍浸潤における細胞表面分子CD44Hの関与が指摘されている。 T.T-1 ESCC細胞株はCD44Hを高レベルで発現し、T.T ESCC細胞由来の同所性腫瘍異種移植モデルで頸部リンパ節から分離した腫瘍細胞から得られたものである 。 このモデルは、腫瘍の成長と浸潤を研究するために使用されるだけでなく、治療後の生存率に対する試験化合物の効果を評価することが可能です。 mTOR阻害剤であるテムシロリムス（この阻害剤は現在腎細胞癌に使用されている）を投与した後、同胞ESCC腫瘍保有動物において生存期間の延長が観察された。 さらに、このモデルは、試験化合物／薬剤の抗腫瘍効果を調べるための前臨床研究において不可欠なツールとして機能する（表3）。

Patient-derived tumor xenograft model

Patient-derived tumor xenograft modelは、上記のモデルよりもさらに進んだがん動物モデルとしてESCCの研究において使用されている。 このモデルは、患者から切除したESCC腫瘍を用い、免疫不全動物で腫瘍異種移植片を開発することで確立されています。 患者腫瘍は、皮下または整形外科的に移植することができる。 腫瘍の移植部位によって、このモデルは皮下および同所性の腫瘍異種移植モデルとしての一定の特徴も保持している。 驚くべきことに、患者腫瘍に由来する腫瘍異種移植片は、ドナー腫瘍と同様に遺伝学的、組織学的、表現型的特性を保持している。 患者由来の腫瘍異種移植片の間質成分や細胞成分はドナー腫瘍と同様に維持されているので、このモデルの使用は、均質な腫瘍細胞株の使用に伴う欠点を除くことができる。 これらの利点にもかかわらず、このモデルは必然的にいくつかの制限に悩まされることになる。 このモデルの確立には、切除された患者の腫瘍を使用する必要があるが、基礎研究室によっては、この標本ソースを入手できない場合がある。 さらに、腫瘍異種移植片を形成するための患者腫瘍の生着率は最適ではなく、腫瘍の種類、腫瘍の移植部位、マウス系統、腫瘍の特徴、患者の特徴など、多くの要因によって変化する . また、移植に成功した患者腫瘍であっても、腫瘍異種移植片に成長するまでに長い潜伏期間を要し、時にはこのプロセスが6ヶ月にも及ぶことがある。 したがって、上記の制限により、腫瘍樹立のプロセスは高コストで手間のかかる手順となっている。 これらの欠点にもかかわらず、このモデルは徐々に他の動物がんモデルに代わって中・後期研究で使用されるようになり、特に新規化合物／薬剤の抗腫瘍効果の前臨床評価には有益である。 実際、このモデルは、腫瘍異種移植片とドナー腫瘍の間の高い類似性により、試験化合物/薬剤の臨床反応を予測する優れた力により、「マウスの臨床試験」と呼ばれることがあります。

すべての利点と欠点を考慮すると、患者由来腫瘍異種移植モデルはESCCの疾患メカニズムを研究するための研究プラットフォームを提供するだけではなく、前臨床薬剤スクリーニングも促進することが可能です。 後者の用途では、このモデルは臨床との関連性が高いため、皮下や同位体モデルよりも好ましく用いられ、新規化合物/薬剤の抗腫瘍効果を評価するために使用することができます。 この分野では、個々の研究チームが、ESCCに対する薬剤や薬剤の組み合わせをスクリーニングするために、腫瘍の不均一性を保った患者由来の腫瘍異種移植モデルのコレクションを独自に確立しています（表4）。

ESCCによく見られる分子制御異常をよく特徴付けた患者由来腫瘍異種移植モデルは、現在使われている薬剤がESCCに新しく使えるかどうかを試すツールとして使うことができます。 このプロセスは、現在の薬物治療に耐性のある患者さんのための新薬の研究として重要である。 シスプラチンと5-フルオロウラシルは、ESCCに使用される化学療法薬ですが、すべての患者さんに良好な薬物応答があるわけではありません。 Zhangらは、薬剤の作用機序をより深く理解するために、患者由来の腫瘍異種移植モデルパネルを確立し、HER2の発現やEGFR（上皮成長因子受容体）、K-ras、B-raf、PIK3CA（ホスファチジルイノシトール-4,5-ビスフォスフェート3-キナーゼ触媒サブユニットα）の変異といった、 ESCCにおいて頻繁に検出される共通の遺伝子異常を十分に特徴づけることにした。 HER2およびPIK3CAの状態がよく分かっている異種移植片のパネルを用いて、シスプラチンと5-フルオロウラシルの治療効果を調べたところ、HER2陰性で野生型PIK3CAを有する腫瘍異種移植片は、PIK3CAの変異状態にかかわらず、HER2陽性異種移植片と比べて治療に対してより敏感であることが分かった。 この研究から得られた結果は、腫瘍の遺伝子組成と化学療法薬の反応性の関係を明らかにした。

従来の化学療法薬の試験に、遺伝子組成を定義した患者由来の腫瘍異種移植モデルを用いる以外に、これらのモデルは、トラスツズマブやラパチニブのようにESCCに対して臨床的に用いられていない薬の抗腫瘍効果を調べるために使用されてきた。 患者由来の腫瘍異種移植片に対するトラスツズマブの効果を調べたところ、HER2陽性のESCCはこの治療に反応したが、PIK3CA変異を同時に持つものには反応しないことが明らかになった。 さらに、これらのHER2陽性かつPIK3CA変異のある腫瘍異種移植片をAKT阻害剤AZD5363で処理すると、その異種移植片は再びtrastuzumab処理に反応するようになった. 別の研究では、患者由来の腫瘍異種移植モデルを用いて、化学療法薬のオキサリプラチンまたは5-フルオロウラシルに対するラパチニブの増感効果を検討した。 ラパチニブと5-フルオロウラシルの併用療法は、ラパチニブ単独やオキサリプラチンとの併用療法よりも強力な増殖抑制効果を示した。 これらの研究は、 前臨床薬物試験におけるこれらのモデルの 有用性を明確に提示しています。 9267＞患者由来の腫瘍異種移植モデルは、ドナー腫瘍と確立された腫瘍異種移植片の組織学的および病理学的関連性が高いため、臨床環境の遺伝的多様性と構成を模倣することができる。 これらの先行研究は、異なる薬剤/化合物の抗腫瘍効果を評価するためのこれらのモデルの前臨床応用を提唱している（表3）。 得られた結果は、ESCCの治療に新しい薬剤／化合物を使用することを支持する確かな証拠となることもある。 したがって、このような前臨床試験は、臨床試験に先立つ重要なプラットフォームを形成している

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