Clostridium botulinum – Botulism (Clinical forms)。 ボツリヌス中毒の診断のための検査。 患者、食品、飼料、汚泥または水生堆積物、水鳥、その他の試料中の毒素を検出する。 推奨検査：検出毒素、C. botulinum培養、型別ボツリヌス毒素；分子診断（PCR）

Clostridium botulinumとボツリヌス毒素/Sの特徴

Clostridium botulinumは厳嫌気性グラム陽性菌、Clostridium属、Clostridiaceae科、芽胞形成性で神経毒性のある毒素を生成する。 この細菌は通常、土壌や未処理の淡水および堆積物（海、湖沼）に存在し、世界中に分布しています。 状況によっては、この細菌は食品を汚染し、その中で増殖して毒素を産生することがある。 ボツリヌス中毒は、この毒素を含む食品を摂取することによって起こる重篤な食中毒である。 この病気はまれですが、その死亡率は高いです。 1899年から1990年にかけて米国で検出された1036例のうち、毒素の種類を調べると、A毒素が384例、B毒素が106例、E毒素が105例、F毒素が3例であった。 9993>

すべてのボツリヌス中毒は、Clostridium Botulinumという細菌が増殖する際に生成するボツリヌス毒素を吸収することによって起こるものである。 この毒素は毒性（神経毒性）が非常に強く、極微量で作用を発揮し、熱に弱いが、細菌の芽胞は耐熱性があり、加熱処理した缶詰など100℃以上に加熱した食品でも生存する。 また、C. botulinum, C. butyricum, C. baratii, C. argentinenseの一部の株はボツリヌス神経毒を産生する。

中和試験により区別できる毒素型（A〜G）があり、臨床や疫学に有用である。 A、B、E、F型はヒトのボツリヌス中毒の主な原因であり、C、D型は動物のボツリヌス中毒の症例に見られ、最も影響を受けるのは野鳥や鶏、牛、馬、魚類の一部種である。 A型とB型は男性に多く、主に家庭で調理された野菜の缶詰の汚染に関係するが、ヨーロッパではこれらの型は肉製品との関連でも見つかっている。 E型（魚類）は水生環境に存在し、汚染された魚介類に関するEボツリヌス症患者と相関があり、増加傾向にあります。 F型は例外的である。 C型はC1（神経毒）とC2（神経毒ではなく、血管透過性と腸管毒性に影響）に細分化される。 G型はC. argentiniense（アルゼンチンの地面、死亡患者の血清から分離、関与は不明）が産生する。

毒素は菌の増殖中に不活性タンパク質（150kDa）として合成され、溶解時に菌体から放出される。 形成された毒素を活性化するためには、2本のポリペプチド鎖（50kDaと100kDa）に分解される必要がある。

C. botulinumは、その培養特性、生化学的および生理学的特性によってグループに区別することができる。 A型はすべて、B型とF型は一部が蛋白分解性を示す。 C.ボツリヌス菌の毒素を産生するCとDの培養液は，凝固卵白や肉を含む培地で培養した場合，タンパク質分解性を示さない。 E型のすべてとB型、F型の一部は非蛋白分解性であるが、非蛋白分解性グループのC型、D型とは異なる糖質代謝の特徴を持つ。 G型の株は、有効かつ満足すべき特徴付けのために十分詳細に研究されていない。

増殖と毒素生成の至適温度は蛋白分解性株では35℃程度、非蛋白分解性株では26〜28℃程度である。 非タンパク質分解型B、E、F株は冷蔵温度（3～4℃）でも毒素を産生できる。 非タンパク質分解株の毒素はトリプシンで活性化された毒素でないと最大毒性を示さない。

ボツリヌス中毒の臨床型

ボツリヌス中毒の臨床型は4つある：

• Clostridium Botulinumに汚染された食物を摂取して、毒素が形成された食中毒（foodborne botulism）である。

• 傷口ボツリヌス症：傷口にボツリヌス菌が感染し、傷口で菌が増殖して生体内で毒素が生成される。

• 乳児ボツリヌス症：ボツリヌス菌が定着した幼児の消化管で毒素が作られ、（最も多い原因は、汚染した蜂蜜やコーンシロップの摂取）その後毒素を吸収して生成される。

• 成人腸管ボツリヌス症は、高齢者の消化管にボツリヌス菌が定着し、その後、毒素が吸収されることによって起こります。

ヒトのボツリヌス中毒のいずれの臨床型においても、また動物のボツリヌス中毒においても、毒素は、食品とともに予め摂取された場合、または消化管に定着した細菌（幼児または成人）により生産された場合、あるいは例外的に細菌に感染した傷口から子供が摂取した場合に、消化管から血液中に浸透する。 ボツリヌス毒素を含む可能性が高い食品はいくつかあります。 pH が 4.5 未満の食品は、この pH では C. botulinum が増殖して毒素を生成することができないため、ボツリヌス中毒の原因になりにくいです（フルーツジュース、酢漬けなどがこれにあたります）。 逆に、pHが4.5と同じかそれ以上の食品は、それらの中で増殖と毒素の産生が可能であるため、ボツリヌス中毒を引き起こす可能性があります（これは肉、魚、野菜、調理済み料理などの場合です）、すべてのこれらの食品に無酸素暴露、缶詰や真空パック食品と同様に、pH4.6より大きいを持っています。 例：生ハム、燻製、魚や野菜の缶詰（芽胞を殺すのに不十分な熱処理を施したもの）等の危険な食品。 C.ボツリヌス菌に汚染された缶は通常湾曲しているが、E型ではこのようなことはない。

吸収された毒素は運動ニューロンの神経筋接合部に不可逆的に結合してアセチルコリンの放出を妨げ、弛緩性麻痺または筋力低下を起こす。

臨床的には急性弛緩性麻痺が特徴で、通常、脳神経の両側性病変で始まり、顔面、頭部、咽頭の筋肉に影響を与え、その後対称的に下降して胸筋、四肢に影響を与える。 死亡する場合は、舌や咽頭筋の麻痺による上気道の閉塞や、横隔膜や肋間筋の麻痺による呼吸不全が原因である。 このため、ボツリヌス抗毒素の投与や呼吸集中治療が必要です。

ボツリヌス症の診断検査

培養せずに試料または食品中のボツリヌス毒素の検出（検査の項「IVAMIが提供する検査と必要な試料」の推奨試料をご参照ください）。

ボツリヌス中毒の臨床的証拠を持つ患者に推奨されます。

ボツリヌス毒素の検出は、血液から得られた血清などの液体で行うことができます。 また、ボツリヌス中毒の症例や発生原因となった食品を食べた跡から検出することも可能です。 食品残渣を用いた検査では、食品残渣から抽出濾液を得ることが必要である。 乳児ボツリヌス症または腸ボツリヌス症の場合、小児または患者の糞便中の毒素の存在を検出することができますが、糞便の予備培養を行うことがより推奨されます（下記参照）。 ボツリヌス毒素の検出は、いずれの場合も、ボツリヌス毒素を接種すると麻痺症状を呈し、その後死亡するマイクに接種することにより行われます。 ボツリヌス毒素を接種したマウスが死亡したことを確認するためには、ボツリヌス毒素が存在したことを確認し、存在するボツリヌス毒素の種類を特定する中和試験が必要である。 この中和試験は、接種物(人または動物の血清、摂取した食物からの抽出物など)と各毒素の特異的な抗血清を接触させて行われる。 したがって、我々は、感染した動物の死を引き起こす最大（最高）希釈率を計算し、接種量は、動物の死が致死最小量（LMD）を含んで引き起こした。

毒素の種類を識別するには、一度 “Minimum Letal dose” を知って、これは異なる抗毒素ボツリヌス型抗血清に直面しています。 これらの混合物は実験マウスに等量で接種され、生き残ったものは、「最小致死量」プラス中和することができたタイプの抗血清の混合物が接種されている。

前培養後のサンプル/製品中の毒素の検出（IVAMIが提供する試験の推奨サンプルと必要サンプルを参照）

サンプル中に毒素を産生するClostridium botulinumが検出された場合、サンプルを培養した後に毒素を調査することが推奨されます。 乳児ボツリヌス症や腸管ボツリヌス症の患者の糞便、菌が増殖した食品の食べ残し（プレザーブ缶など）、菌の混入が疑われる食品（膨らんだプレザーブなど）、この菌の存在を排除するための管理下の食品（例えば…。

実験室で適当な培地で培養すると、菌がいれば毒素が生成されるので、その培養濾液を得て、その濾液をマウスに接種してその存在を調査することが有効である。 接種されたマウスが影響を受けた場合、サンプル中のClostridium botulinumが培養で増殖している可能性が高いことを示す。

培養液中のボツリヌス毒素の存在を確認するには、ボツリヌス毒素の種類に応じた特異的抗血清による中和試験（中和試験）や、培養液中のClostridium botulinum遺伝子やその種類の検出（PCRによる分子検出）が可能である。

中和試験は、接種した試料（培養ろ液）と毒素の種類に応じた特異的な抗血清を接触させて行う。

中和試験の前に、最小致死量（MLD）を算出する必要がある。 このように、接種した動物の死を引き起こす（最高）最大希釈率を計算し、接種した量が動物の死を引き起こした最小致死量を含む。

毒素の種類を特定するために、いったん「最小致死量」が判明したら、異なる種類の抗ボツリヌス血清と最小致死量の対決が行われる。 これらの混合物を実験用マウスに等量接種し、生き残ったマウスには「最小致死量」と中和できるタイプの抗血清の混合物を接種する。

PCRによる分子検出により、最小致死量（MLD）の計算と中和試験に要する時間が短縮される。

抗ボツリヌス毒素抗体の検出（IVAMIが提供する検査と必要なサンプルの項の推奨サンプル後を参照）

• 美容または医療治療のためにボトックスを投与される患者など、希釈したボツリヌス毒素で治療を受ける患者（e． ボツリヌス毒素の作用を阻害する抗体の存在を検出するため。

• 乳児ボツリヌス症または成人ボツリヌス症の疑いがあり、糞便または血清からボツリヌス毒素の細菌を検出できなかった患者。

• ワクチン接種者で、予防の状況を確認したい方

クロストリジウム・ボツリヌス毒素は、非常に高い希釈率で、痙攣過程の治療に局所投与で使用されています。 これらのプロセスは、有用な治療法であることが示されています。 これらのプロセスは通常、慢性的な痙性であるため、毒素が永続的に投与されることが必要である。 したがって、治療中に患者の免疫化が進行するために耐性が生じる可能性があり、その場合、効果は限定的である。 この免疫化を検出するためには、ボツリヌス毒素Aおよび/またはBに対する抗体の存在を正確かつ高感度に測定することが必要である。

ボツリヌス毒素に対する抗体を検出し、定量するために認められた参照方法は、マウスにおける中和試験（Mouse Neutralization Assay）であり、マウスに対する致死量50％（DL50）で定量したボツリヌス毒素の希釈液を、血清／血漿の種々の塩基2または塩基4希釈物と混ぜ、培養後にそれぞれマウス群に腹腔内接種させるものである。 毒性を低下させる試験血清の最高希釈率は、対応するボツリヌス毒素に対する抗体価に相当する。 この希釈度を国際標準と比較することにより、国際単位（IU/mL）で結果を得ることができます（1IUは毒素AまたはBの10,000LD50、あるいはE型の1000LD50を中和する抗体量と定義されます）。 試験に用いる毒素の量は、A型、B型、E型それぞれについて、0.02；0.005；0.0125 IU/mLの抗毒素によって中和されるものである（Hatheway et al.1984）。 1：4のマウス力価を保護する血清は、A型では<0.08 IU / mL、B型では<0.02 IU / mLと報告されています。この試験は、手間と費用がかかり時間もかかるため、ボツリヌス毒素でコーティングしたマイクロプレートを用いて、ELISA法に基づく代替法が模索されています。 しかし、ELISA法で得られた値は、マウスを用いた中和試験と十分な相関がない場合がある。

中和試験の前に、毒素の最小致死量（DLM）を計算することが必要である。 最小致死量の算出は、培養ろ液を10倍希釈し、その半分を生理食塩水で希釈し、患者の血清または血漿と混合した毒素と同じ希釈率とし、それぞれの希釈混合物を実験用マウスに接種することにより行います。 このようにして、感染動物が死亡する（最高）最大希釈率を算出する。 このとき接種した動物が死亡した量を最小致死量（MLD）とする。

最小致死量がわかったら、一定量の抗毒素の存在下で、接種したマウスが死なない最小量の毒素に相当する最小非致死量（dmnm）を計算します。 この毒素は対応する単位の抗A抗毒素または抗B抗毒素によって中和される。 最小非致死量は、抗毒素の存在下でマウスを死亡させない最小量の毒素であることから、このように呼ばれている。

IVAMIが提供する検査と必要なサンプル：

• 食中毒のヒト例または発生におけるボツリヌス毒素検出：

• • マウスへの接種および毒素タイピングに使用された最も新しい患者の血清（少なくとも5 mL）、もしマウスに影響があった場合は、このサンプル。

• • 乳児ボツリヌス症や腸管ボツリヌス症の場合、小児／患者の糞便からボツリヌス毒素を検出することができますが、糞便の予備培養を行うことがより望ましいと思われます。
  • 摂取した食品、ボツリヌス中毒を引き起こす疑いのある食品、または管理対象の食品中の毒素および/またはClostridium Botulinumの検出
  • • マウス接種と食品中の予備形成毒素の存在を検知するためのサンプルを準備するための疑いまたは確認食品のサンプル（少なくとも約100gを推奨します）。 また、マウスに接種するための濾液を得るための培養を行い、サンプル中に毒素産生菌が存在するかどうかを判定するためのものです。 残餌しかない場合は、利用可能な全量を送ることをお勧めします。
    • 乳児ボツリヌス症または腸管ボツリヌス症の症例におけるClostridium botulinumの検出
    • • 腸管結節による乳児ボツリヌス症または腸管結節の症例の糞便（10g）、培養および培養ろ液を用いマウスへの接種による毒素検出のため。

      創傷ボツリヌス症症例におけるClostridium botulinumの検出

    • • 創傷ボツリヌス症が疑われる症例の滲出液、マウス接種による培養液濾液中の毒素の検出のため。 好気的に搬送された場合、ボツリヌス菌が失活している可能性があるため、ボツリヌス菌遺伝子の有無を分子検査し、陽性であれば各ボツリヌス毒素に対応する遺伝子を検出し、ボツリヌス毒素の種類を特定するとより簡便であると考えられる。
      • 淡水汚泥又は水生海底堆積物の試料中のクロストリジウム・ボツリナムの検出、及び前項以外の製品
      • • クロストリジウム・ボツリナム増殖用の培養を行ってマウス接種用培養ろ液を取得するにはおよそ100g試料である。
        • 血清又は血漿中の抗ボツリヌス毒素抗体の検出
        • • 血清又は血漿（約10mL）、実験室で利用できる異なる毒素に対する血清又は血漿中の中和抗体を検査するためである。 この検査は、ボツリヌス毒素の治療を受けた人、乳児ボツリヌス症の疑いのある患者、便から細菌を見つけられなかった成人、またはワクチン接種を受けた人の防御状態を確認するために、特異抗体の存在を確認するために行われます。 ボツリヌス毒素を投与された人の場合 患者に投与された毒素の種類を表示する必要があります。

          Time for report of results (TAT)

          • 正確な時間は申し上げられませんのでご了承ください。 マウス接種による毒素の検出のみの検査で、結果が陰性であれば、結果報告は最大1週間となります。 サンプルを培養し、マウスの培養濾液を接種して作った毒素を検出する検査を含む場合は、2週間程度となります。 これらのテストのマウス接種、サンプルまたは培養濾液からの抽出物のいずれかが陽性であった場合、中和試験は、ボツリヌス毒素であることを裏付け、中和試験によってその型を識別するためにマウスで行われるべきで、完了時間は15日である
          • リアルタイムPCRテストレポートは3または4日です。

          製品特性および選択された試験を記載した用紙

          • 製品の試験実施を申請する場合、製品の特性および送付したサンプルで実施する試験を選択した文書を提出する必要があります。

          サンプル量

          • IVAMIが提供する試験の種類によって異なります。

          サンプルの保管条件と発送

          • サンプルは通常見られる状態で、輸送用に保護されて発送されます。 細菌に汚染され、またはそれ自身の有機物によって腐敗する可能性のあるサンプル（生鮮食品、動物またはヒトの血清、糞便、汚泥、… …）の場合、サンプルは冷凍保存、または少なくとも輸送中の冷却を確実にする条件下で（サンプル容器を冷凍保冷パックで箱-膨張ポリスチレン-（白コルク）内に入れて輸送する必要があります。 注：この生物自体には生物学的曝露による汚染のリスクはありません。

          検査費用

          • 食中毒ボツリヌス症のヒト事例/発生における毒素検出
          • • マウスへの患者からの血清または摂取した食物の抽出物の接種・・・・・・・・・・・・・・・。………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………[email protected]

            を参照してください。

          • • If it is positive, confirmatory test for neutralization and identification of the type of toxin …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consult [email protected] .
          • Detection of toxin and/or Clostridium botulinum in foods ingested, suspected of causing botulism, or food subject to control
          • Detection of Clostridium botulinum in cases of infant botulism or intestinal botulism
          • • Optional: Mice inoculation test with serum or extract from ingested food ………………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………Consult [email protected]
            • Recommended. Culture test, followed by mice inoculation with culture filtrate ………………………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consult [email protected]
            • If it is positive, confirmatory test for neutralization and identification of the type of toxin ……………………. …………………………………………………………………………………………………………..Consult [email protected]
          • Detection of Clostridium botulinum in cases of wound botulism
          • • Culture test, followed by mice inoculation with culture filtrate ……………………. [email protected]
            • 陽性の場合、中和および毒素の種類の同定のための確認試験 …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………[email protected]
            • 前項以外の汚泥／淡水又は海底堆積物等の試料中のClostridium botulinumの検出
            • • 培養試験後，培養ろ液をマウスに接種 …………………………………………………………………………………………………………………………. Consult [email protected]
              • If it is positive, confirmatory test for neutralization and identification of the type of toxin ………………. …………………………………………………………………………………………………………..Consult [email protected]
            • Detection of anti-botulinum toxin in serum or plasma (refers to a type of antibody, so must indicate the type of toxin administered to the individual) ……………………………………………….. Consult [email protected]