Abstract

精液中の亜鉛、マグネシウム、カルシウムの健康カップルの妊娠までの期間（TTP）への影響、従来の精液パラメータおよびコンピュータ支援精液分析（CASA）パラメータへの影響を検討した。 精漿と精子におけるキレート可能な亜鉛イオンの局在をオートメタログラフィー（AMG）により評価した。 総亜鉛量が多い試料と少ない試料におけるキレート可能な亜鉛の局在の差異を評価した。 TTPの短いカップル25組とTTPの長いカップル25組の精液試料を、通常の精液分析、CASA、誘導結合プラズマ質量分析法による亜鉛とマグネシウムの測定、炎原子吸光分析法によるカルシウムの測定に供した。 陽イオンは強い相互相関を示したが、TTPや従来の精液パラメータとの相関は認められなかった。 亜鉛濃度の高い精液サンプルは、亜鉛濃度の低いサンプルに比べ、CASAパラメータの直線速度および直線性で評価した運動性が統計的に有意に不良であることが示された。 カルシウム濃度も同じパラメータで統計的に有意な差を示したが、亜鉛濃度を重回帰モデルに入力することにより、その影響は除去された。 総亜鉛量が多い精液サンプルは、AMGにおける精漿の染色性が強いことが示された。 高濃度の精液亜鉛は、精子の進行性運動（「運動の質」）には抑制効果を示すが、運動性精子の割合（「運動の量」）には抑制効果を示さないことが示唆された。

はじめに

哺乳類の精液中の総亜鉛量は多く、亜鉛は精子形成に重要であることが分かっています。 亜鉛の欠乏は、ヒトでは性腺機能低下症や二次性徴の不十分な発達と関連し（Prasad, 1991）、ラットでは精細管の萎縮とそれによる造精不全を引き起こす（Millarら, 1958; Underwood, 1977; Endreら, 1990）。 高濃度の亜鉛は精細胞の酸素摂取を抑制し (Huacuja et al., 1973; Foresta et al., 1990)、アルブミンによる先体反応 (Foresta et al., 1990) を抑制することが報告されている。 頭尾部の付着／剥離、核クロマチンの凝縮／脱凝結も精亜鉛の影響を受けている（Kvist, 1980; Bjorndahl and Kvist, 1982）。 精液中の亜鉛が精子の運動性に及ぼす影響については、相反する報告がある (Stankovic and Mikac-Devic, 1976; Danscher et al., 1978; Caldamone et al., 1979; Lewis-Jones et al., 1996)。 亜鉛イオンのキレート化が精子の運動性に影響を与えることが実証されており（Saito et al., 1967; Danscher and Rebbe, 1974）、精液中の総亜鉛ではなく、小胞高分子量タンパク質に結合した生体内亜鉛が精子機能に対する亜鉛の影響の指標となるべきとも言われている（Bjorndahl et al., 1991; Carpino et al., 1998）

本研究は主に亜鉛を対象とする。 健康なカップルを対象に、精液中の亜鉛、そしてある程度マグネシウムとカルシウムと妊娠までの期間（TTP）との関連性を評価した。 さらに、これらの二価陽イオンと従来の精液パラメータおよびコンピュータ支援精液分析（CASA）パラメータとの相関を評価した。

オートメタログラフィー（AMGZn）は、組織中の亜鉛イオンおよび疎結合亜鉛イオン（キレート化亜鉛）を検出する組織化学手法の一つである。 総亜鉛量が多い男性と少ない男性の精子と精液における、光学顕微鏡および電子顕微鏡レベルでの亜鉛イオンの局在の違いを調べた。

材料と方法

研究対象

4労働組合の52 255人の組合員の中から合計430組を募集した。 430組の夫婦から精液を採取し、運動性を手動およびCASA（後述）で評価し、さらに分析するまで精液を凍結保存した（-20℃）。 生殖経験のないカップルは避妊を中止した時点で登録し、最低6回の完全な月経周期または妊娠が認められるまで追跡調査した． 430組のうち、妊娠した50組のカップルを本研究の対象として選んだ。すなわち、TTPが最も短い25組（S-TTP、中央値1ヶ月、範囲1〜2ヶ月）と、TTPが最も長い25組（L-TTP、中央値10ヶ月、範囲7〜28ヶ月）であった。 3707>

従来の精液特性

精液サンプルは、推奨される3日間の禁欲後、50mlの滅菌ポリスチレン瓶に自慰行為によって得られた。 液化後、サンプルはWHOの基準（1992年）に従って室温で分析された。

容量は10ml目盛り付きファルコンガラス管（精度0.1ml）で測定された。 手動による精子運動性の評価は、Makler counting chamber (Sefi Medical Instruments, Haifa, Israel)で行った。 遭遇した各精子を以下のように評定した：a：急速進行性運動、b：遅いまたは緩慢な進行性運動、c：非進行性運動、d：無動性。 少なくとも2×100のスコアを実施した。 連続した2つのカウントの差が10％を超えた場合、新たに2つのカウントを行った。 運動性精子細胞の割合は、「a＋b＋c」グループと定義した。 濃度はマクラー式計数装置で測定し、形態は、エタノールとエーテルで固定し、パパニコロウ法で染色した風乾塗抹標本について、Krugerら（1986）が記述したTygerberg `strict’ 基準に従って分類した（世界保健機関、1992）。 形態学的な採点は、訓練を受けた1人の検査技師が行った。 精子の生存率はエオシン-ネグロシン染色した塗抹標本で判定した。

Computer-assisted semen analysis

CASA用の材料は以下のように入手した。 新鮮でよく混ざった精子4.5μlをピペットで深さ10μmのマクラーカウントチャンバーに移した。 試料を、加熱プレート（37℃）を備えたオリンパスBH-2位相差顕微鏡（オリンパスデンマークA/S、グロストルップ、デンマーク）内に、倍率200倍で設置した。 ソニー製ビデオカメラDXC-107（ソニー株式会社、東京、日本）により、ソニー製PVM-1440QMカラービデオモニター（ソニー株式会社、東京、日本）に画像を転送した。 JVC HR-D560EG/Eビデオカセットレコーダー（JVCビクター株式会社，東京都）にて録画した． 記録は、後に、Hobson Sperm Tracker (Hobson Tracking Systems Ltd, Sheffield, UK) で、取得周波数25Hz、追跡時間2秒（合計50フレーム）、視野300×300μm（最大150μm/sのすべての直線速度値を検出できる）で分析された。 3707>

解析の結果、曲線速度（VCL）、直線速度（VSL）、直線性（LIN）、平均経路速度（VAP）、側頭変位振幅（ALH）が導き出されました。

精液中の亜鉛、マグネシウム、カルシウムの測定

精液中の亜鉛、マグネシウム、カルシウムは全50検体で測定した。 精液中の亜鉛とマグネシウムの濃度は誘導結合プラズマ質量分析法（ICP-MS）で測定した。 装置はFisons Elemental (Winsford, Cheshire, UK)のPQ2+を使用した。 20μlのアリコートを、5g/lの25%アンモニア（ARISTAR; Merck, Poole, UK），0.5g/l EDTA（Janssen Chimica, Geel, Belgium），0.5g/l Triton X-100（Sigma, St Louis, MO, USA）、18MW Millipore水、を含む溶液で100倍に希釈した。 内部標準として、スカンジウム（AccuStandard, New Haven, CT, USA）を最終濃度100μg/lになるように添加した。 すべての試料は二重に調製した。 亜鉛とマグネシウム（AccuStandard）を最終濃度1、2、3 mg/lになるように添加したブランク試料を使用してキャリブレーションを行った。 この分析は、24Mg, 66Zn, 45Scで測定するピークジャンピングモードで行われた。

カルシウムの測定は、同じ調製物で炎原子吸光分析（FAAS）を用いて行われた。 装置はPerkin-Elmer 306 (Norwalk, CT, USA)を使用した。 原精液試料中の100、200、400mg/lに相当する濃度について較正を行った。 カルシウム濃度の高い試料は、検量線に入るようにさらに3倍に希釈した。

試料と同じ機会に用意した10個のブランク試料の標準偏差の3倍として計算した検出限界は、亜鉛が1 mg/l, マグネシウムが3 mg/l, カルシウムが2 mg/l でした（精液試料中の希釈前の濃度として表現されます）。 また、10検体について炎色原子吸光分析法（FAAS）による亜鉛の定量を行った結果、亜鉛は18％、マグネシウムは32％、カルシウムは17％でした。 ICP-MSとFAASの結果の線形回帰分析では、0.79の傾き（95％信頼区間：0.58-1.00）、13 μg/lの切片、0.90のr2が得られました。 3707>

Autometallographical (AMG) development of semen smears for light microscopic analysis

ICP-MSで測定した亜鉛含有量が高い（242～308 mg/l）5サンプルと低い（38～57 mg/l）5サンプルを0.5％の硫化ナトリウム（Bie & Berntsen）で30分インキュベートして硫化亜鉛格子にしました。 射精液/硫化物溶液をファーマーで洗浄したスライドグラスに塗抹した。 この塗抹標本を風乾し、3％グルタルアルデヒド（Bie & Berntsen）で30分間固定し、0.1Mリン酸緩衝液で3×2分間、蒸留水で2分間静置した

その後、AMG現像して硫化亜鉛格子を銀増幅した。 現像液は60mlのろ過したアラビアゴム溶液（1kgを2lの蒸留水に溶解；Bidinger A/S, Aarhus, Denmark）、10mlのクエン酸ナトリウム緩衝液および15mlの温蒸留水に溶解した0.85gハイドロキノン（Merck, Darmstadt, Germany）から構成されていた。 使用直前に、15mlの蒸留水に溶かした0.11gの乳酸銀（Fluka, Buchs, Switzerland）を加え、溶液を十分に混合した。

精液塗抹標本を入れたファーマー洗浄瓶を26℃水浴に入れ、光密封ボックスに移した。

現像後、スミアは流水脱イオン水で10分間洗浄し、5%チオ硫酸ナトリウムで5分間、流水脱イオン水で2分間洗浄、70%エタノールで30分間ポストフィックスし、最後に流水脱イオン水で2分間洗浄された。 対比染色は、0.1％トルイジンブルー水溶液、pH4.0（1000mlの緩衝液に1gのトルイジンブルーを含む）で行った。 614.5 ml 0.1 M クエン酸一水和物および 385.5 ml 0.2 M リン酸水素二ナトリウム二水和物; Merck, Darmstadt, Germany)。 このスミアは蒸留水中で2×2分、99%エタノール中で3×3分、キシロール中で3×3分置き、最後にDEPEX (Merck, Darmstadt, Germany) でマウントした。

電子顕微鏡分析用の精液スミア

DEPEXでマウントしない以外は上記のように精液サンプルのスミアは準備された。 0.5%四酸化オスミウムを30分間加えた後、スミアは緩衝液中で3×2分、蒸留水中で1×2分置いた。 オスミウムでコントラストをつけた塗抹標本を光学顕微鏡で観察し、さらなる電子顕微鏡分析のために関心のある領域をダイヤモンドナイフでマークした

選択した塗抹標本を段階的エタノール溶液で脱水し、エポン（Bie & Berntsen）に埋め込んだ。 あらかじめマークした関心領域の上に置いたEponブロックを60℃で24時間保持し、ガラススミアから破砕した。 半薄切片（3μm）を切り出し、スライドグラスに載せた。 光学顕微鏡による分析後、選択した切片をEponに再包埋し、超薄切片を作成し、クエン酸鉛で対比染色してからJEOL 100S電子顕微鏡で検査した。

統計方法

個々のパラメータが結果に及ぼす影響を検出するために重回帰分析をデータに適用した。 Spearmanの順位相関係数はいくつかの相関について計算された。 グループの比較のために、中央値の差に関するWilcoxon rank-sum検定が実行された。 2標本t検定によるS-TTP対L-TTPの2群におけるこれらのパラメータの中央値の比較は、これらのパラメータのいずれについても統計的に有意な差異を明らかにしなかった。 亜鉛、マグネシウム、カルシウムの間には強い正の相互相関が認められた（スピアマンの順位相関係数は 0.79-0.86, P < 0.01）（Figure 1）

いずれの陽イオンも従来の精液パラメータのいずれとも密接な相関は認められなかった。 すべてのデータに対して重回帰分析を行ったところ、亜鉛含有量だけが以下のCASAパラメータに対してP値0.05未満となった。 VSL 0.04、LIN 0.008。 マグネシウムまたはカルシウムのいずれかをモデルに入力しても、値は改善されませんでした。

精液サンプルは、各陽イオンの状態に応じて、同じ大きさの2つのグループに分けられました。 亜鉛112mg/l、マグネシウム98mg/l、カルシウム476mg/lという分割点（全50サンプルの中央値）が確認された。 2つのグループ間で統計的に有意な差が多数検出された（表II）。 亜鉛群のP値は最大の差を示し、カルシウム群は中間の差を示し、マグネシウム群はわずかな差しか示さなかった（LINを除く）。

陽イオン間の相対比率（表III）の分岐点は：亜鉛：マグネシウム1.26、亜鉛：カルシウム0.22である。 亜鉛：カルシウムの比率が0.22以上の試料は、0.22未満の試料と比較して、CASAパラメータVSL、LIN、STRの値が統計的に有意に低くなっていることが確認されました。 亜鉛：マグネシウムの相関は0.86（スピアマンの順位相関係数）、亜鉛：カルシウムの相関は0.79であった。 亜鉛の含有量はカルシウムの含有量よりもマグネシウムの含有量と密接な関係があるようで、これがグループ間の差を説明していると思われる。

AMG製剤中の亜鉛イオン含有量を評価したところ、総亜鉛量が少ない試料では、総亜鉛量が多い試料と比較して、光学顕微鏡レベルで差が検出されました。 図2は、精液中の亜鉛が299mg/lの試料と53mg/lの試料におけるAMGの染色の違いを示しています。 先体、尾部、精漿の染色は、総亜鉛量が少ない試料ではまばらであることがわかった。 これらの所見を電子顕微鏡レベルで確認することはできず（図3A）、特に精子の細胞内染色に差は見られなかった。 図3Bおよび図4は、精子尾部における亜鉛イオンの局在を示したものである。 亜鉛イオンは尾部全体に存在し、鞭毛付属繊維と膜に集中している。 精漿ではマイクロメーターサイズの小体が亜鉛イオンを豊富に含んでいることがわかった（図5）

Discussion

これは我々の知る限り、健常人のTTPとCASAパラメータに対する精液の亜鉛、マグネシウム、カルシウムの影響を評価した最初の研究である。 高亜鉛濃度とVAP、VSL、STR、LINの低下で表される精子運動の直線性の低さの間に関連性が見いだされた。 マグネシウムとカルシウムの濃度は亜鉛濃度と密接な相関があったが、CASAパラメータとの関連はそれほど強くなかった。 運動性濃度は亜鉛、マグネシウム、カルシウムの総濃度に影響されないことが判明した。 しかし、亜鉛の高濃度対低濃度では、いくつかのCASAパラメータに違いが見られた（表II）。 亜鉛総量が最も少ない25の精液サンプル（中央値72 mg/l）と最も多い25の精液サンプル（中央値187 mg/l）を比較すると、Wilcoxon順位和検定により、LIN（P = 0.001）と同様にVSL（P = 0.004）でも中央値に統計的に有意差のあることが判明した。 VAPについても、その差は有意であった（P = 0.02）。 VCL については、差は認められなかった。 亜鉛が少ない試料と多い試料で運動率や運動濃度に差がなかったことから、亜鉛が多い環境は精子細胞をよりランダムに、より前進的に運動させると思われる。 VSLは精子細胞が一定時間内にどこまで直進するかを表すもので、臨床的にはCASAのパラメータの中で最も重要であると思われる。 Moore and Akhondi (1996) によるラット精巣上体精子の受精能に関する研究では、VSLの低下はin vitroでの受精結果と強い負の相関を示した。

長年にわたり、精子機能における精液の亜鉛の役割について多くの議論がなされている。 精子頭部は精液よりも何倍も高い濃度で蓄積し、亜鉛はクロマチンの安定性と適切なタイミングでクロマチンが脱落する能力に不可欠であり (Kvist, 1982; Kvist and Bjorndahl, 1985; Kvist et al., 1987, 1988) 、頭部と尾部が分離する固有の機構の保存者として亜鉛の生理的役割が示唆されている (Bjorndahl and Kvist, 1982)。 しかし、精液中の亜鉛が精子の運動性に及ぼす影響については相反する報告があり、ほとんどの研究は定量的な評価を扱っている。 Lewis-Jonesら（1996）の研究では、不妊治療のために紹介された1178人の患者の精液中の亜鉛とフルクトース濃度を測定しましたが、亜鉛については運動率との統計的に有意な相関は認められませんでした。 Abou-Shakra ら（1989）は、ICP-MS を用いて精液中の微量元素を測定したが、正常精子、乏精子、無精子症の男性において、精液中の亜鉛濃度と精子密度または運動率の相関は検出されなかった。 彼らの研究における亜鉛の濃度は、この研究で示された濃度と同様であった。 Danscherら（1978）は高亜鉛濃度が精子運動性の低下と関連すると報告しているが、他の研究者は精液中の高亜鉛含有量が精子細胞運動性の高さと関連すると報告している（Stankovic and Mikac-Devic, 1976; Caldamone et al. 超微細構造レベル（図2A）では総亜鉛量の高低による精子中の亜鉛イオン量の差は認められなかったが、光学顕微鏡レベル（図1）で認められた特徴は、精漿中の総亜鉛量と遊離亜鉛イオンとの関係を反映していると思われる。 最近の研究では、Lewis-Jonesら（1996）およびCarpinoら（1998）は、精子形成活性のマーカーとして総亜鉛量は信頼性が低く、小胞型高分子量タンパク質に結合した生体内亜鉛イオンがより良い指標となると結論づけている。 ここで紹介するAMG法は、キレート性の亜鉛、すなわち血漿中の亜鉛イオンまたは高分子と緩く結合した亜鉛を示すものである。 タンパク質と強固に結合した亜鉛はAMGでは検出されず、キレート化することもできません。 私たちは、精子細胞の運動性などの機能を発揮するのは生物学的に利用可能な（つまりキレート可能な）亜鉛であるという前述の研究結果に同意します。 この研究は、亜鉛の総量とキレート可能な亜鉛の濃度が関連していることを示している。 亜鉛の効果とは対照的に、高濃度のマグネシウムはそれ自体で精子の運動性を阻害する効果はないようであった。 LINに負の効果が認められましたが、他のCASAパラメータに影響を与えるほど大きくはありませんでした。 ヒトの精漿には前立腺由来の分泌顆粒や小胞が存在し、それらの環境中の必須陽イオン濃度を調節することによって精子の運動性を調節する効果がある可能性が報告されている（Stegmayrら、1982）。 これらの小器官の膜には、Zn2+によって競合的に阻害されるMg2+およびCa2+依存性ATPaseが存在する (Ronquist et al., 1978a,b) 。 精漿中の亜鉛とマグネシウムの間には高い正の相関があることが以前報告されており(Papadimas et al., 1983; Umeyama et al., 1986)、本研究でも3つの陽イオン間に同様の強い相互相関が認められた(r = 0.79-0.86, P < 0.01)

＜2154>カルシウムは運動性を含む精子生理学に重要である (Morton et al., 1974; Lindemann et al., 1987）、代謝（Peterson and Freund, 1976）、先体反応、受精（Yanagimachi and Usui, 1974; Yanagimachi, 1981）など、精子の生理機能に重要である。 しかしながら、精子の運動性における精液カルシウムの役割については、十分に理解されていない。 ThomasとMeizel（1988）は、細胞外のカルシウムイオンをEGTAでキレートすると先体反応は抑制されるが、同時に運動性には影響を与えないことを見出した。 二価カチオンのイオノフォアであるイオノマイシンを添加しても運動性には影響がなかったが、先体反応する精子細胞数は有意に増加した。 Magnusら（1990）は、イオン化カルシウム濃度と進行性運動を示す精子の割合との間に関連性がないことを見いだした。 ArverとSjöberg（1982）は、低電離カルシウムがより多く、より良い進行性運動をする精子と関連することを報告している。 Prienら（1990）は、精子運動が正常（＜2223＞60％）および低下（＜2889＞60％）の患者において、精子運動、速度、および進行性運動を総カルシウムおよびイオン化カルシウムと比較した。 総カルシウムには差がなかったが、精液中のイオン化カルシウムは運動率の低下した男性で統計的に有意な減少が認められた。 この研究では総カルシウムが測定されたが、精漿のカルシウム結合能は不明である。 カルシウムについては、運動性濃度への影響は検出されず、CASAパラメータとの相関は亜鉛の相関よりも弱かった（表II）。 VSLとLINはともに総カルシウム濃度と逆有意な相関を示したが（ともにP = 0.02）、VCLは影響を受けなかった。 しかし、亜鉛濃度を重回帰分析に加えると、総カルシウム濃度が運動性に及ぼす影響は取り除かれた。 これは、先に述べた Prien ら (1990) の研究と一致する。 この研究では、亜鉛：カルシウムの比率が低いサンプルは、高い比率のサンプルと比較して、統計的に有意に優れたCASA値（VSL、LIN、およびSTR）を示した。 これは主に亜鉛濃度の違いによるものである。

この研究における亜鉛、マグネシウム、カルシウムの測定精度は比較的悪く、変動係数はそれぞれ18、32、17%であった。 原因はおそらく試料の不均一性で，試料量が少ないこと（20μl）と相まって精度が落ちたと思われる。 3707>

これまでに、亜鉛イオンのキレートが精子の運動性に影響を与えることが、人 (Danscher and Rebbe, 1974), ネズミ、犬 (Saito et al., 1967; Stoltenberg et al., 1997) で証明されています。 現在、亜鉛イオンの細胞内・細胞外キレート化の研究が進められており、精液中や精子細胞内の亜鉛イオンの位置の重要性が明らかになるかもしれない

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