La microscopía es esencial en muchos aspectos de la micología. Tiene 3 usos principales:

1. Detección de hongos directamente en muestras clínicas – las apariencias particulares pueden ser muy características de ciertas infecciones, por ejemplo la infección por Zygomycete o la tinta china en el líquido cefalorraquídeo. La microscopía directa, si es positiva, es más rápida que el cultivo.
2. Confirmación de que un cultivo de un hongo transportado por el aire, como Aspergillus, es la causa de la infección y es poco probable que sea un contaminante.
3. Identificación de hongos, basada en las apariencias morfológicas.

La sección siguiente es bastante técnica y específica y está escrita para el trabajador de laboratorio que desea mejorar las tasas de detección y las habilidades de notificación.

Esta tabla muestra los principales tipos de muestras y hallazgos utilizados para la microscopía directa.

Muestra	Hongos detectables y aspecto
CSF	Las levaduras de Cryptococcus	Preparación de tinta china.
Cabello, uñas y raspados de piel	Hifas de dermatofitos u otros hongos filamentosos Hongos de Candida	Diferentes hongos no distinguibles. Los cultivos suelen ser negativos, por lo que la microscopía sólo evidencia la infección.
La mucosa de los senos paranasales	Las hifas detectables en la mucosa son diagnósticas de rinosinusitis fúngica eosinofílica	La mucosa debe fijarse y teñirse como en los cortes histopatológicos. Las hifas pueden ser esquivas.
Restos de oído/raspado	Hifas, generalmente con cabezas esporulantes típicas de Aspergillus niger.	Ocasionalmente mezcladas con Candida y células de levadura.
Raspado corneal para queratitis	Pueden verse levaduras u hongos filamentosos	Signo temprano útil de queratitis micótica, no distingue las especies causantes
Aspiración de tejido o biopsia	Hifas de hongos filamentosos Las levaduras de Candida u otras levaduras. Esférulas de C. immitis	Algunos hongos muy característicos incluyendo pequeñas levaduras sin hifas que sugieren C. glabrata, o hifas no septadas de un Zygomycete.
Los fluidos respiratorios	Las levaduras no son significativas Las hifas (sin levaduras) son consistentes con la enfermedad Pneumocystis jirovecii	Las hifas suelen estar septadas y son típicas de Aspergillus, pero si no están septadas, considere la zigomicosis o la mucormicosis. Imuunofluorescencia superior para P. jirovecii
Película sanguínea o médula ósea	Las levaduras intracelulares típicas de Histoplasma o raramente de Penicillium	Característica de la histoplasmosis diseminada y encontrada en el 40%.
Líquido peritoneal	Las levaduras o raramente las hifas	Ayuda a confirmar la peritonitis por Candida peritonitis
Pincel vaginal	Candida albicans (levaduras e hifas) o Candida glabrata	Clave diagnóstica
Granos de micetoma	Pueden mostrar hifas con características	No suelen ser definitivas con respecto a la especie

Metodología de la tinción

La preparación específica más antigua para la microscopía es una solución concentrada (10-20%) de hidróxido de potasio, que ablanda la queratina y permite la visualización directa de los hongos y una cierta evaluación de la morfología. Las tinciones de Gram son menos sensibles. Las tinciones de Papanicolau pueden ser útiles. Los portaobjetos de citología pueden teñirse con tinciones de plata o de Gomori Methenamine Silver (GMS). La microscopía de inmunofluorescencia es el mejor método para detectar Pneumocystis. Los abrillantadores fluorescentes (Calcofluor white, Blankophor o Tinopal UNPA-GX), que se unen a la quitina de la pared celular fúngica, son un medio rápido de escanear las muestras en busca de hifas fúngicas, y mejoran la evaluación de la morfología.

La función diagnóstica de la microscopía en enfermedades específicas

El LCR y la meningitis

Las células de Cryptococcus encapsuladas pueden detectarse a menudo en muestras de LCR u otros fluidos o secreciones del huésped montadas en tinta china. Alrededor del 50% de los pacientes VIH-negativos y más del 80% de los VIH-positivos tienen un examen positivo de tinta china del LCR. Sin embargo, los linfocitos intactos, en particular, pueden confundirse con el organismo. En las personas con SIDA, las células de Cryptococcus suelen ser abundantes en el LCR, aunque las cápsulas pueden ser pequeñas, lo que dificulta su reconocimiento. Los hallazgos persistentemente positivos en el LCR en pacientes sometidos a tratamiento deben considerarse evidencia de fracaso o recaída sólo si se confirman por un deterioro del estado clínico del paciente o por cultivos positivos.

Preparación con tinta china del LCR que muestra múltiples levaduras con cápsulas grandes y brotes estrechos que dan lugar a células hijas más pequeñas, típicas de C. neoformans

Micrografía electrónica de transmisión de una célula de C. neoformans observada en el LCR de un paciente con SIDA con muy poca cápsula presente. Estas células pueden confundirse con linfocitos.

Un hongo filamentoso en el LCR de un paciente con meningitis que creció Candida albicans en un cultivo posterior.

Cabello

Las muestras del cuero cabelludo deben incluir las raíces del cabello, el contenido de los folículos tapados y las escamas de la piel. Salvo en el caso de los favus, la porción distal del cabello infectado rara vez contiene algún hongo. Por esta razón, los pelos cortados sin raíces son inadecuados para la investigación micológica. Un método útil para recoger material del cuero cabelludo es el muestreo con cepillo de pelo.

El examen microscópico directo del material infectado debería revelar artroconidias del dermatofito situadas fuera (ectotrix) o dentro (endotrix) del pelo afectado. Los artroconidios pueden ser de tamaño pequeño (2-4 um de diámetro) o grande (hasta 10 um de diámetro). Las escamas de la piel contienen hifas y artroconidias. En la infección por T. schoenleinii (favus), se observan cadenas sueltas de artroconidias y espacios de aire dentro de los pelos afectados. El escúter (costra) está formado por micelio, neutrófilos y células epidérmicas.

Raspado de piel que muestra hifas filamentosas con blankophor.

Uñas

La calidad de la muestra tomada es un factor importante para el éxito o no de la microscopía y el cultivo. La toma de muestras debe ser indolora, aparte de una ligera molestia ocasional cuando se toman muestras subungueales. La figura siguiente muestra los lugares apropiados de los que deben obtenerse muestras de uñas,

Los raspados tomados con un bisturí romo o los recortes deben transportarse en un cuadrado de papel doblado, preferiblemente sujeto con un clip, pero también existen paquetes micológicos comerciales. En el laboratorio, se añade una solución de hidróxido de potasio al 20-30% a una parte de la muestra para macerar la queratina de la uña y poder examinar la muestra en busca de elementos fúngicos mediante microscopía directa. Alternativamente, una parte de cada muestra se examina en una solución de disolución de uñas que contiene un fluorocromo. Este es un ejemplo de solución reactiva. Se prepara disolviendo 1 g de Na2S en 7,5 ml de agua destilada y añadiendo posteriormente 2,5 ml de etanol. A continuación, se añaden a esta mezcla 10 ml de Blankophor o 20 ml de solución acuosa al 1% de Tinopal UNPA-GX (abrillantador fluorescente 28, F3543; Sigma).

Mucosa de los senos paranasales

Una característica diagnóstica de la rinosinusitis fúngica alérgica (AFRS) es la presencia de mucina eosinofílica que contiene hifas, recogida de la nariz del paciente o de las cavidades de los senos paranasales sin evidencia de invasión tisular por hongos. Las hifas pueden ser escasas en el contenido de los senos paranasales y tardan mucho en visualizarse con las tinciones utilizadas actualmente. Sin esta característica positiva, suelen hacerse otros diagnósticos, como la rinosinusitis alérgica (RSA) o la rinosinusitis eosinofílica por mucina (RME). Sin embargo, el uso de técnicas de diagnóstico mucho más sensibles, como la tinción de quitina o las tinciones específicas de inmunofluorescencia anti-Alternaria, puede mejorar la sensibilidad. Las características diagnósticas de apoyo incluyen la presencia de cristales de Charcot-Leyden, erosión ósea y opacidad heterogénea con expansión de los senos en la tomografía computarizada.

Canal auditivo y otitis externa

Se deben obtener restos y secreciones del canal auditivo. El examen microscópico directo revelará hifas ramificadas, células de levadura en ciernes o ambas cosas. En los casos de infección por Aspergillus, a veces pueden verse las típicas cabezas de esporas.

Raspado corneal para queratitis

La queratitis por hongos es una emergencia médica y debe reconocerse y tratarse rápidamente. Para el diagnóstico microbiológico, la mejor muestra es el material de la parte afectada de la córnea; el material puede recogerse en forma de raspados de una zona ulcerada o de una biopsia cuando el epitelio corneal está intacto y la infección se limita al estroma corneal. Los raspados corneales se obtienen utilizando un instrumento como una espátula de platino, una cuchilla Beaver, un cuchillo Bard Parker nº 15 o un cuchillo romo para cataratas. Los bastoncillos con punta de algodón son menos eficaces para desbridar la descamación corneal necrótica. Se debe recoger material de la base y los bordes de la parte ulcerada de la córnea repetidamente. Si el material se ha extendido sobre un medio estéril, la misma cuchilla o espátula puede utilizarse de nuevo para recoger material adicional; sin embargo, si el material ha entrado en contacto con un portaobjetos no estéril, debe cambiarse la cuchilla, mientras que la espátula puede flamearse, enfriarse y reutilizarse.

El examen microscópico directo de frotis teñidos de material de raspado corneal es el medio más rápido para realizar un diagnóstico presuntivo. Las hifas hialinas septadas de los hongos filamentosos observados podrían representar especies de Aspergillus, Fusarium o Acremonium. Pueden verse hifas septadas coloreadas de feohifomicetos como Curvularia. En ocasiones, Candida spp. es la causa de la queratitis, por lo que pueden verse levaduras e hifas, lo que sugiere este diagnóstico. La microscopía confocal puede ser un medio más directo para establecer el diagnóstico.

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a. Un raspado corneal con azul de algodón de lactofenol muestra hifas separadas con Fusarium spp o Aspergillus spp. Dr. Philip Thomas, Tiruchirappalli ( a &b )
b. Otro raspado de córnea teñido con azul de algodón de lactofenol que muestra hifas septadas en forma de cuentas que no son típicas ni de Fusarium spp ni de Aspergillus spp, La detección microscópica de las típicas células de levadura en ciernes, las pseudohifas y/o las verdaderas hifas de la especie Candida en secciones de tejido o en fluidos corporales normalmente estériles es indicativa de candidiasis invasiva. Normalmente, C. glabrata sólo produce células de levadura, y sólo C. albicans produce hifas verdaderas en los tejidos

Tinción de un fluido centrifugado (en este caso orina) que contiene C. albicans, mostrando las formas de levadura e hifas, tan frecuentes en este tipo de muestras.

Muestras respiratorias
El examen del esputo es útil en la ABPA, ya que a menudo pueden verse hifas con eosinófilos y cristales de Charcot Leyden. Ocasionalmente, las infecciones fúngicas poco comunes pueden diagnosticarse por microscopía cuando se visualizan esférulas o levaduras grandes como Blastomyces dermatitidis. En el material de lavado bronquial de la traqueobronquitis fúngica pueden verse Aspergillus u otras hifas filamentosas, a veces con cabezas esporulantes visibles. La microscopía tiene un mayor rendimiento que el cultivo en la aspergilosis pulmonar invasiva a partir de muestras de BAL, en algunos centros dependiendo del método utilizado. Ningún estudio ha comparado las metodologías de rendimiento de la microscopía o del cultivo fúngico.

Tapón mucoso examinado por microscopía óptica con KOH, que muestra una red de hifas hialinas ramificadas típicas de Aspergillus, de un paciente con ABPA.

La misma preparación de una muestra de BAL que muestra hifas hialinas y septadas consistentes con Aspergillus, teñidas con Blankophor a la izquierda y KOH a la derecha.

Preparación de KOH de un fluido respiratorio que muestra amplias hifas no septadas, típicas de un Zygomycete.

Película de sangre o médula ósea

La sensibilidad de la microscopía de la sangre y la médula ósea no es lo suficientemente alta para la mayoría de las infecciones fúngicas como para justificar el tiempo de examen de las muestras, con la excepción de la histoplasmosis diseminada y el Penicillium marneffei, generalmente en el SIDA.

Granos de micetoma

El diagnóstico del micetoma depende de la identificación de los granos, que deben obtenerse preferentemente de una pústula no rota (seno) utilizando una aguja estéril. Se debe levantar el techo de la lesión y exprimir el contenido del seno, incluidos los granos, y colocarlo en un portaobjetos de vidrio. Cada grano debe ser recogido, enjuagado en alcohol al 70% y luego lavado en solución salina estéril antes de ser cultivado. El examen microscópico directo de los granos en hidróxido de potasio al 20% confirmará el diagnóstico de micetoma y también revelará si el organismo causante es un hongo o un actinomiceto. Los granos negros sugieren una infección fúngica; los granos blancos diminutos suelen indicar una infección por Nocardia y los granos blancos más grandes del tamaño de una cabeza de alfiler pueden ser de origen fúngico o actinomicético. Los granos pequeños y rojos son específicos de Actinomadura pelletieri, pero los granos blancos amarillentos pueden ser de origen actinomicótico o fúngico. Los granos actinomicóticos contienen filamentos muy finos (<1 um de diámetro), mientras que los granos fúngicos contienen masas de hifas cortas enredadas (2-4 um de diámetro) que a veces están pigmentadas.

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