In de jaren zestig werden twee mijlpalen bereikt in de fysiologie van de intestinale suikerabsorptie. De eerste was de Na+-glucose cotransport hypothese van Crane en collega’s (1), die actief suikertransport verklaarde, en de tweede was de ontdekking van glucose en galactose malabsorptie (GGM) bij patiënten (5, 6). De cotransport-hypothese is uitvoerig getest, bevestigd en uitgebreid tot het “actieve transport” van een grote verscheidenheid van substraten in cellen, variërend van ophoping van lactose in Escherichia coli tot ophoping van jodide in de schildklier. In wezen zijn cotransporters moleculaire machines die energie gebruiken die is opgeslagen in de vorm van elektrochemische potentiaalgradiënten van ionen over celmembranen, Na+ of H+, om de accumulatie van specifieke oplosmiddelen en water in cellen aan te drijven (22). De intestinale Na+-glucose cotransporter (SGLT1) gebruikt Na+ en elektrische gradiënten over het membraan om suiker en water tegen hun concentratiegradiënten in enterocyten binnen te drijven (9, 13, 23). Glucose en galactose worden beide verwerkt door SGLT1, terwijl fructose over de borstelgrens wordt getransporteerd door zijn eigen transporteur, de gefaciliteerde fructose transporter (GLUT5). Glucose, galactose en fructose voltooien hun reis door de cel naar het bloed via een andere gefaciliteerde suikertransporter (GLUT2) in het basolaterale membraan (Fig.1).

GGM wordt gekenmerkt door neonatale waterige en zure ernstige diarree, die binnen enkele weken fataal is tenzij lactose (glucose en galactose) uit het dieet wordt verwijderd (2). De diarree stopt met vasten of het verwijderen van de beledigende suikers uit het dieet, maar wordt onmiddellijk hervat bij orale toediening van lactose-, glucose- of galactosebevattende diëten. De absorptie van fructose wordt niet beïnvloed. Gezien de symptomen van de ziekte en wat toen bekend was over de intestinale suikerabsorptie, werd voorspeld dat GGM te wijten was aan een defect in de penseelgrens Na+-glucose cotransporter. Deze hypothese werd versterkt door de uitmuntende autoradiografische galactose opname en chlorizine bindingsexperimenten gedaan op mucosale biopten van de eerste Amerikaanse GGM patiënt (17, 18). Deze experimenten toonden aan dat de vermindering van het galactose transport gepaard ging met een vermindering van 90% van de florizine binding aan de penseelgrens. Phlorizine is een specifieke, niet getransporteerde, competitieve remmer van SGLT1.

De meest betrouwbare diagnostische test voor GGM is de H2-ademtest (Fig.2). Orale toediening van glucose of galactose (2 g/kg) leidt bij patiënten met GGM tot een verhoging van de H2-adem tot ver boven 20 delen/miljoen, maar niet bij controles of patiënten die fructose toegediend krijgen. Kinderen met GGM gedijen “normaal” op fructosevervangende formules, maar de symptomen komen zelfs op volwassen leeftijd terug met slechts een theelepel glucose (6 g), en de H2-ademtest blijft positief. De ziekte is vrij zeldzaam. Ons zijn wereldwijd ongeveer 200 patiënten bekend, en een groot deel van de gevallen is afkomstig uit consanguine verwantschap.

De fysiologie en pathofysiologie van de intestinale suikerabsorptie werden in 1987 bevorderd door het klonen van de Na+-glucose cotransporter door een nieuwe strategie die wij “expressie klonen” noemden. Dit succes werd snel gevolgd door het klonen (4) van de menselijke Na+-glucose cotransporter door Turk en Hediger en de identificatie door Turk et al. (20) van de eerste mutatie in een cotransporter die een genetische ziekte, GGM, veroorzaakte. Wij verkregen darmbiopsies van twee zusters met de diagnose GGM en bloedmonsters van de ouders die neef en nicht zijn. Turk et al. (20) identificeerden een homozygote, missense mutatie (Asp28Asn) in het SGLT1 cDNA van elke zuster, vonden dat elke ouder drager was voor deze mutatie, en toonden aan dat de mutatie inderdaad Na+-glucose cotransport volledig opheft met behulp van een oöcyte expressie assay. In dezelfde familie werd vervolgens een prenatale screening uitgevoerd op twee foetussen, waarbij de ene (de broer van de proband) drager bleek te zijn van de Asp28Asn-mutatie en de andere (een neef) normaal bleek te zijn. Beide kinderen deden het goed zonder dieetbeperking en bleven ten minste twee jaar asymptomatisch (11).

Verdere vooruitgang werd aanvankelijk belemmerd door moeilijkheden bij het verkrijgen van slijmvliesbiopsiestalen van kinderen met GGM, totdat Turk et al. (21) erin slaagden het volledige menselijke SGLT1-gen in kaart te brengen. Het gen is groot, met 15 exonen verdeeld over 72 kb DNA. Zodra de exonen en hun flankerende regio’s waren gesequencet, werd een enkelstrengs conformationeel polymorfisme assay ontwikkeld om patiënten te screenen op mutaties met gebruikmaking van genomisch DNA uit een klein bloedmonster. Deze ontwikkeling omvatte PCR amplificatie van elk van de 15 exonen en hun intron-exon juncties en gelelectroforese van de gedenatureerde PCR-producten om exonen met mutaties te identificeren. De afwijkende exonen werden vervolgens gesequeneerd. Om te bepalen of de mutaties verantwoordelijk waren voor het defect in suikertransport, werden de mutanten in Xenopus laevis oöcyten tot expressie gebracht voor Na+-glucose-opname assays. Martı́n (Refs. 10, 12, en ongepubliceerde waarnemingen) was grotendeels verantwoordelijk voor deze fase van het project. Mutaties die verantwoordelijk zijn voor de ziekte werden geïdentificeerd in 33 van 34 onderzochte GGM patiënten. De patiënten van 17 stammen hadden homozygote mutaties, en in nog eens 10 stammen hadden de patiënten samengestelde heterozygote mutaties. Deze omvatten 22 missense mutaties (zie Fig.3) en 4 splice-site en 3 nonsense mutaties die resulteren in de productie van een sterk afgekapt SGLT1 eiwit. Dat er bij de 34e patiënt geen mutaties werden gevonden, komt wellicht doordat de mutatie zich in de promotorregio van het gen bevond en DNA uit dit gebied niet in de screeningprocedure was opgenomen.

Als transportfysioloog ben ik geïnteresseerd in de GGM missense mutaties vanwege hun potentieel voor het identificeren van residuen in het eiwit die cruciaal zijn voor transport. Daarom zijn we begonnen te bepalen hoe missense mutaties het defect in Na+-suikertransport veroorzaken. In deze benadering, die voor een groot deel werd uitgevoerd door Lostao (zie Refs. 10 en 12), werden de mutante eiwitten in X. laevisoocyten tot expressie gebracht en vervolgens werden biofysische en biochemische methoden gebruikt om het niveau van het eiwit in de cel en in het plasmamembraan te bepalen. In gevallen waarin de transporter in het plasmamembraan was ingebracht, onderzochten wij (7) de deelreacties van de transportcyclus. Aanvankelijk waren wij teleurgesteld te moeten vaststellen dat bij de eerste 21 onderzochte missense mutanten het primaire defect te wijten was aan foutmutatie van de transporters in de cel. Op basis van Western blots werden alle mutanten gesynthetiseerd op niveaus vergelijkbaar met, of hoger dan, de wild-type SGLT. Laadmetingen (7) en vriesfractuur-elektronenmicroscopie (24) van het plasmamembraan van de eicel toonden echter aan dat het aantal cotransporters in het plasmamembraan sterk was verminderd (10, 12). Afgaande op de mate van kern- en complexe glycosylering van de mutanten, vond het defect in de transport van SGLT1 naar het plasmamembraan plaats tussen het endoplasmatisch reticulum en de Golgi of de Golgi en het plasmamembraan. Verkeerde vouwing van mutante eiwitten kan de voornaamste oorzaak zijn van missortering van de transporter (19). In slechts één geval, Gln457Arg, was het mutante eiwit in het plasmamembraan van de eicel in de buurt van normale niveaus.

Wat voor relevantie hebben deze experimenten op eicellen voor de darmen van GGM patiënten? Om dit te beantwoorden onderzochten wij (ongepubliceerde gegevens) de distributie van SGLT1 eiwit door immunocytochemie in de mucosale biopten van drie patiënten met homozygote mutaties. Bij alle drie was de distributie van de mutante eiwitten in de eicel identiek aan de distributie van SGLT1 in de enterocyten van de patiënt: bij twee bevond het eiwit zich in het cytoplasma, en bij één bevond het eiwit zich in de borstelrand. Er is ook overeenstemming tussen onze resultaten op oöcyten en die verkregen door autoradiografische studies van biopten van de eerste Amerikaanse GGM-patiënt (18). Stirling en zijn medewerkers (18) vonden dat de binding van phlorizine aan de penseelgrens van de patiënt met 90% was verminderd, en wij vonden geen gemuteerd SGLT1 eiwit (Cys355Ser en Leu147Arg) in het plasmamembraan van de eicel (10). Deze studies suggereren dat, tenminste met deze vier GGM mutanten, de oöcyt het gedrag van het gemuteerde eiwit in de enterocyt recapituleert.

Een belangrijke vraag die overblijft is hoe de missense mutaties verdeeld over het eiwit (Fig. 3) de transport van de transporter naar het plasmamembraan verstoren. Antwoorden op deze vraag zijn belangrijk voor het begrijpen van de biosynthese van plasmamembraaneiwitten en voor het bedenken van verbeterde therapieën voor kinderen met GGM.

De GGM-mutatie in één verwantschap, Gln457Arg, heeft een onschatbaar inzicht verschaft in het mechanisme van suikertransport. Lostao bestudeerde (in voorbereiding) het gedrag van Q457R SGLT1 uitgedrukt in oöcyten en het darmslijmvlies van de patiënt en ontdekte dat het eiwit wordt vertaald, geglycosyleerd, en ingebracht in het plasmamembraan, maar het is niet in staat om suiker te transporteren. In afwezigheid van suiker transporteert het mutante eiwit Na+ via het Na+ lek of de Na+ uniport route, en dit wordt geblokkeerd door chlorizine. Glucose is ook een remmer omdat het ook deze Na+ transportroute blokkeert, wat erop wijst dat glucose bindt aan Q457R SGLT1 maar dat het niet wordt getransporteerd, d.w.z. dat de mutatie een suiker-translocatiedefect veroorzaakt. Panayotova-Heiermann en collega’s (15) toonden onafhankelijk aan dat de suiker “porie” door SGLT1 wordt gevormd door het COOH-terminale domein van SGLT1 met residu Q457.

Om deze waarnemingen te benutten hebben we de rol van Q457 in suiker translocatie onderzocht. In deze studie bleek de cysteïnemutant Q457C zijn volledige Na+-glucose transport activiteit te behouden, afgezien van een verhoging van de schijnbare glucose Michaelis-Menten constante (Km) van 0,4 tot 6 mM, en chemische mutagenese van Q457C met zowel geladen als neutrale alkylerende reagentia (methanethiosulfonaten, MTS) bleek het suikertransport volledig te blokkeren. Echter, omdat het gealkyleerde Q457C eiwit glucose bindt met een dissociatieconstante die zeer vergelijkbaar is met de schijnbare Km voor suikertransport door Q457C SGLT1, moet dit residu geen deel uitmaken van de suikerbindingsplaats. De remming van suikertransport door Q457C door MTS trad alleen op wanneer de cotransporter in de naar buiten gerichte Na+ conformatie, C2, stond (Fig.4). Het reagens was niet effectief in afwezigheid van Na+, in aanwezigheid van Na+ en glucose (of chlorizine), of in aanwezigheid van Na+ bij gedepolariseerde membraanpotentialen. Spanningssprong experimenten met rhodamine-gelabelde Q457C toonden ook aan dat het tijdsverloop en het niveau van de fluorescentie de overgang van de cotransporter tussen conformatie C2 en C6 op de voet volgden (Fig. 4). Wij interpreteren deze resultaten zo dat de cotransporter in ten minste drie verschillende conformaties (C6, C2 en C3) kan bestaan en dat de koppeling tussen Na+ en suikertransport plaatsvindt via ligand- en spanningsgeïnduceerde conformatieveranderingen in het eiwit.

Preliminaire studies met twee andere GGM missense mutaties in het COOH-terminale domein van SGLT1, A468V en R499H (Fig. 3), tonen aan dat het vervangen van de residuen door cysteïnen de trafficking van het eiwit naar het plasmamembraan van de eicel herstelt. Beide eiwitten zijn functioneel, en suikertransport wordt geblokkeerd door MTS-reagentia. Net als in het geval van Q457C, zijn deze residuen alleen toegankelijk voor MTS-reagentia wanneer de eiwitten in de C2-conformatie zijn. Deze resultaten ondersteunen mijn opvatting dat de transmembraan helices 10-13 (Fig. 3) de suiker porie vormen. Verder werk is nodig om de Na+ porie te identificeren.

Samenvattend hebben moleculair biologische studies naar SGLT1 geleid tot het klonen van het cDNA voor het menselijke SGLT1 en het in kaart brengen van het gen, wat krachtige nieuwe hulpmiddelen heeft opgeleverd om de fysiologie van Na+-glucose cotransport te onderzoeken en GGM te bestuderen. Het is bevestigd dat GGM wordt veroorzaakt door mutaties in het SGLT1-gen, en de meeste van deze mutaties resulteren in ofwel afgeknot SGLT1-eiwit of een foutieve geleiding van de transporter in de cel. Zoals verwacht voor een autosomaal recessieve ziekte, veroorzaakt een eigen mutatie de ziekte in elke bloedverwantschap en neemt de frequentie van de ziekte toe in culturen met een hoge frequentie van consanguine huwelijken. Hoewel GGM zeldzaam is, is het mogelijk dat de grotere groep van personen met milde SGLT1-mutaties, of ernstige mutaties op één allel, een gestoorde glucose- en galactose-absorptie heeft. Ongeveer 10% van de normale populatie, medische studenten, gaf positieve glucose H2 ademtests (14). Dit raakvlak tussen fysiologie en ziekte heeft niet alleen het inzicht in de pathofysiologie van suikerabsorptie vergroot, maar ook nieuwe benaderingen opgeleverd om de moleculaire mechanismen van de koppeling tussen Na+ en suikertransport over plasmamembranen te bestuderen.

FOOTNOTES

• * Eerste in een reeks gastartikelen over genetische aandoeningen van membraantransport.