W latach 60-tych XX wieku osiągnięto dwa kamienie milowe w fizjologii jelitowego wchłaniania cukru. Pierwszym z nich była hipoteza kotransportu Na+-glukozy Crane’a i współpracowników (1), która wyjaśniała aktywny transport cukru, a drugim odkrycie złego wchłaniania glukozy i galaktozy (GGM) u pacjentów (5, 6). Hipoteza kotransportu została wyczerpująco przetestowana, potwierdzona i rozszerzona o “aktywny transport” szerokiej gamy substratów do komórek, od akumulacji laktozy w Escherichia coli do akumulacji jodków w tarczycy. Zasadniczo, kotransportery są maszynami molekularnymi, które wykorzystują energię zmagazynowaną w postaci gradientów potencjału elektrochemicznego jonów, Na+ lub H+, przez błony komórkowe, do napędzania akumulacji specyficznych rozpuszczalników i wody w komórkach (22). Jelitowy kotransporter Na+-glukozy (SGLT1) wykorzystuje Na+ i gradienty elektryczne przez błonę, aby kierować cukier i wodę do enterocytów wbrew ich gradientom stężeń (9, 13, 23). Glukoza i galaktoza są obsługiwane przez SGLT1, podczas gdy fruktoza jest transportowana przez granicę szczoteczkową przez swój własny prywatny transporter, ułatwiony transporter fruktozy (GLUT5). Glukoza, galaktoza i fruktoza kończą swoją podróż przez komórkę do krwi przez inny ułatwiony transporter cukru (GLUT2) w błonie podstawnej (Rys.1).

GM charakteryzuje się wystąpieniem u noworodków wodnistej i kwaśnej ciężkiej biegunki, która jest śmiertelna w ciągu kilku tygodni, chyba że laktoza (glukoza i galaktoza) zostanie usunięta z diety (2). Biegunka ustępuje na czczo lub po odstawieniu szkodliwych cukrów z diety, ale szybko powraca po doustnym podaniu diety zawierającej laktozę, glukozę lub galaktozę. Wchłanianie fruktozy nie jest zaburzone. Biorąc pod uwagę objawy choroby i to, co było znane na temat jelitowego wchłaniania cukrów w tamtym czasie, przewidywano, że GGM jest spowodowany defektem kotransportera Na+-glukozy na granicy szczoteczek. Hipoteza ta została wzmocniona przez doskonałe autoradiograficzne eksperymenty wychwytu galaktozy i wiązania floryzyny wykonane na biopsjach błony śluzowej od pierwszego amerykańskiego pacjenta z GGM (17, 18). Eksperymenty te wykazały, że zmniejszenie transportu galaktozy było związane z 90% zmniejszeniem wiązania chloriziny na granicy szczoteczek. Floryzyna jest specyficznym, nietransportowanym, kompetycyjnym inhibitorem SGLT1.

Najbardziej wiarygodnym testem diagnostycznym w kierunku GGM jest test oddechowy H2 (ryc. 2). Doustne podanie glukozy lub galaktozy (2 g/kg) powoduje wzrost stężenia H2 w oddechu znacznie powyżej 20 części/milion u pacjentów z GGM, ale nie powoduje takiego wzrostu u osób z grupy kontrolnej lub pacjentów karmionych fruktozą. Dzieci z GGM rozwijają się “normalnie” na preparatach zastępujących fruktozę, ale objawy powracają nawet w wieku dorosłym przy spożyciu zaledwie łyżeczki glukozy (6 g), a wynik testu oddechowego H2 pozostaje dodatni. Choroba ta jest dość rzadka. Wiemy o około 200 pacjentach na całym świecie, a duża część przypadków pochodzi z pokrewieństwa.

Fizjologia i patofizjologia jelitowego wchłaniania cukru zostały zaawansowane w 1987 r. dzięki sklonowaniu przez nas króliczego kotransportera Na+-glukozy za pomocą nowatorskiej strategii, którą nazwaliśmy “klonowaniem ekspresyjnym”. Sukces ten szybko nastąpił po sklonowaniu przez Turka i Hedigera (4) ludzkiego kotransportera Na+-glukozy i zidentyfikowaniu przez Turka i wsp. (20) pierwszej mutacji w transporterze, która spowodowała chorobę genetyczną, GGM. Uzyskaliśmy biopsje jelitowe od dwóch sióstr, u których zdiagnozowano GGM oraz próbki krwi od rodziców, którzy są kuzynami. Turk i wsp. (20) zidentyfikowali homozygotyczną mutację typu missense (Asp28Asn) w cDNA SGLT1 od każdej z sióstr, stwierdzili, że każde z rodziców było nosicielem tej mutacji i wykazali, że rzeczywiście mutacja ta całkowicie znosi kotransport Na+-glukozy przy użyciu testu ekspresji oocytów. W tym samym rodzaju, prenatalne badania przesiewowe zostały następnie przeprowadzone na dwóch płodach i jeden (rodzeństwo probanda) okazał się być nosicielem mutacji Asp28Asn, a drugi (kuzyn) okazał się być normalny. Oba dzieci rozwijały się bez ograniczeń dietetycznych i pozostawały bezobjawowe przez co najmniej dwa lata (11).

Dalszy postęp był początkowo utrudniony przez trudności w uzyskaniu próbek biopsji błony śluzowej od dzieci z GGM, dopóki Turk i wsp. (21) nie zdołali zmapować całego ludzkiego genu SGLT1. Gen ten jest duży, ma 15 eksonów rozmieszczonych w 72 kb DNA. Po zsekwencjonowaniu eksonów i ich regionów flankujących opracowano metodę jednoniciowego polimorfizmu konformacyjnego do badania przesiewowego pacjentów w kierunku mutacji z wykorzystaniem genomowego DNA z małej próbki krwi. Rozwój ten obejmował amplifikację PCR każdego z 15 eksonów i ich połączeń intron-ekson oraz elektroforezę żelową zdenaturowanych produktów PCR w celu zidentyfikowania eksonów niosących mutacje. Anomalne eksony były następnie sekwencjonowane. Aby określić, czy mutacje były odpowiedzialne za defekt w transporcie cukru, mutanty zostały wyrażone w oocytach Xenopus laevis do testów wychwytu Na+-glukozy. Martı́n (ref. 10, 12, i niepublikowane obserwacje) był w dużej mierze odpowiedzialny za tę fazę projektu. Mutacje odpowiedzialne za chorobę zostały zidentyfikowane u 33 z 34 badanych pacjentów GGM. Pacjenci w 17 rodach nosili mutacje homozygotyczne, a w kolejnych 10 rodach pacjenci mieli mutacje złożone heterozygotyczne. Obejmowały one 22 mutacje typu missense (patrz ryc. 3) oraz 4 mutacje typu splice-site i 3 mutacje typu nonsense, które prowadzą do wytworzenia silnie okrojonego białka SGLT1. Niewykrycie mutacji u 34. pacjenta może wynikać z faktu, że mutacja znajdowała się w regionie promotorowym genu, a DNA z tego obszaru nie zostało włączone do procedury przesiewowej.

Jako fizjolog transportu, byłem zainteresowany mutacjami missense GGM ze względu na ich potencjał w identyfikacji pozostałości w białku krytycznym dla transportu. Dlatego postanowiliśmy ustalić, w jaki sposób mutacje typu missense faktycznie powodują defekt w transporcie Na+-cukru. W tym podejściu, przeprowadzonym w dużej mierze przez Lostao (patrz ref. 10 i 12), zmutowane białka w X. laevisoocytes były wyrażane, a następnie metody biofizyczne i biochemiczne były używane do określenia poziomu białka w komórce i w błonie plazmatycznej. W przypadkach, w których transporter był wprowadzony do błony plazmatycznej, badaliśmy (7) częściowe reakcje cyklu transportowego. Byliśmy początkowo rozczarowani, gdy stwierdziliśmy, że w przypadku pierwszych 21 badanych mutantów typu missense pierwotny defekt wynikał z nieprawidłowego przemieszczania się transporterów w komórce. Na podstawie Western blots, wszystkie mutanty były syntetyzowane na poziomie podobnym lub wyższym niż SGLT typu dzikiego. Jednakże, pomiary ładunku (7) i liofilizowana mikroskopia elektronowa (24) błony plazmatycznej oocytu wykazały, że liczba kotransporterów w błonie plazmatycznej była znacznie zmniejszona (10, 12). Jak sądzono na podstawie stopnia glikozylacji rdzeniowej i złożonej mutantów, defekt w przemieszczaniu SGLT1 do błony plazmatycznej wystąpił między retikulum endoplazmatycznym a Golgim lub Golgim a błoną plazmatyczną. Błędne formowanie zmutowanych białek może być główną przyczyną nietrafienia transportera (19). Tylko w jednym przypadku, Gln457Arg, zmutowane białko było w błonie plazmatycznej oocytu w pobliżu normalnych poziomów.

Jakie znaczenie mają te eksperymenty na oocytach dla jelit pacjentów z GGM? Aby odpowiedzieć na to pytanie, zbadaliśmy (dane niepublikowane) dystrybucję białka SGLT1 metodą immunocytochemii w biopsjach śluzówki od trzech pacjentów z homozygotycznymi mutacjami. U wszystkich trzech, dystrybucja zmutowanego białka w oocycie była identyczna z dystrybucją SGLT1 w enterocytach pacjenta: w dwóch białko znajdowało się w cytoplazmie, a w jednym białko znajdowało się w granicy szczotki. Istnieje również zgodność między naszymi wynikami dotyczącymi oocytów a tymi uzyskanymi w badaniach autoradiograficznych biopsji od pierwszego amerykańskiego pacjenta z GGM (18). Stirling i jego współpracownicy (18) stwierdzili, że wiązanie floryzyny do granicy szczoteczkowej pacjenta było zmniejszone o 90%, a my nie znaleźliśmy zmutowanego białka SGLT1 (Cys355Ser i Leu147Arg) w błonie plazmatycznej oocytów (10). Badania te sugerują, że przynajmniej z tymi czterema mutantami GGM, oocyt odtwarza zachowanie zmutowanego białka w enterocycie.

Głównym pozostałym pytaniem jest, w jaki sposób mutacje missense rozmieszczone w całym białku (ryc. 3) zakłócają trafficking transportera do błony plazmatycznej. Odpowiedzi na to pytanie są ważne w zrozumieniu biosyntezy białek błony plazmatycznej i w opracowaniu ulepszonych terapii dla dzieci z GGM.

Mutacja GGM w jest w jednym krewnym, Gln457Arg, dostarczyła nieocenionego wglądu w mechanizm transportu cukru. Lostao badał (w przygotowaniu) zachowanie Q457R SGLT1 wyrażonego w oocytach i błonie śluzowej jelita pacjenta i stwierdził, że białko jest tłumaczone, glikozylowane i wstawiane do błony plazmatycznej, ale nie jest w stanie transportować cukru. W nieobecności cukru, zmutowane białko transportuje Na+ przez szlak przecieku Na+ lub uniportu Na+, i jest to blokowane przez floryzynę. Glukoza również jest inhibitorem, ponieważ również blokuje tę ścieżkę transportu Na+, co wskazuje, że glukoza wiąże się z Q457R SGLT1, ale nie jest transportowana, tj. mutacja powoduje defekt translokacji cukru. Panayotova-Heiermann i współpracownicy (15) niezależnie wykazali, że “por” cukru przez SGLT1 jest tworzony przez COOH-końcową domenę SGLT1 noszącą resztę Q457.

Aby wykorzystać te obserwacje, zbadaliśmy rolę Q457 w translokacji cukru. W tym badaniu stwierdzono, że mutant cysteinowy Q457C zachowuje pełną aktywność transportu Na+-glukozy, poza wzrostem pozornej stałej Michaelisa-Mentena (Km) glukozy z 0,4 do 6 mM, a mutageneza chemiczna Q457C z naładowanymi lub neutralnymi odczynnikami alkilującymi (metanetiosulfonianami, MTS) okazała się całkowicie blokować transport cukru. Jednakże, ponieważ alkilowane białko Q457C wiąże glukozę ze stałą dysocjacji bardzo podobną do pozornej Km dla transportu cukru przez Q457C SGLT1, reszta ta nie może być częścią miejsca wiążącego cukier. Hamowanie transportu cukrów przez Q457C za pomocą MTS występowało tylko wtedy, gdy kotransporter znajdował się w konformacji Na+ skierowanej na zewnątrz, C2 (Rys.4). Odczynnik ten nie był skuteczny w nieobecności Na+, w obecności Na+ i glukozy (lub floryzyny), ani w obecności Na+ przy zdepolaryzowanych potencjałach błonowych. Eksperymenty skoków napięcia z użyciem Q457C znakowanego rodaminą również wykazały, że przebieg czasowy i poziom fluorescencji ściśle podążał za przejściem kotransportera pomiędzy konformacjami C2 i C6 (Rys. 4). Interpretujemy te wyniki jako oznaczające, że kotransporter może istnieć w co najmniej trzech różnych konformacjach (C6, C2, i C3) i że sprzężenie między transportem Na+ i cukrów zachodzi poprzez zmiany konformacyjne białka wywołane przez ligand i napięcie.

Wstępne badania z dwoma innymi mutacjami GGM missense w COOH-terminalnej domenie SGLT1, A468V i R499H (Ryc. 3), pokazują, że zastąpienie reszt cysteinami przywraca trafficking białka do błony plazmatycznej oocytu. Oba białka są funkcjonalne, a transport cukrów jest blokowany przez odczynniki MTS. Podobnie jak w przypadku Q457C, reszty te s± dostępne dla odczynników MTS tylko wtedy, gdy białka znajduj± się w konformacji C2. Wyniki te potwierdzają mój pogląd, że transmembranowe heliksy 10-13 (Rys. 3) tworzą pory cukrowe. Konieczne są dalsze prace w celu zidentyfikowania porów Na+.

Podsumowując, badania biologii molekularnej nad SGLT1 doprowadziły do sklonowania cDNA dla ludzkiego SGLT1 i mapowania genu, które dostarczyły potężnych nowych narzędzi do zbadania fizjologii kotransportu Na+-glukozy i do badania GGM. Potwierdzono, że GGM jest spowodowana mutacjami w genie SGLT1, a większość z tych mutacji skutkuje albo obciętym białkiem SGLT1, albo błędnym ukierunkowaniem transportera w komórce. Jak można się spodziewać w przypadku choroby dziedziczonej autosomalnie recesywnie, prywatna mutacja wywołuje chorobę w każdym pokrewieństwie, a częstość jej występowania wzrasta w kulturach o dużej częstości małżeństw spokrewnionych. Chociaż GGM występuje rzadko, możliwe jest, że większa grupa osób noszących łagodne mutacje SGLT1 lub ciężkie mutacje na jednym allelu ma upośledzone wchłanianie glukozy i galaktozy. Około 10% normalnej populacji, studentów medycyny, dało pozytywny wynik testu oddechowego glukozy H2 (14). Ten interfejs między fizjologią a chorobą nie tylko zwiększył zrozumienie patofizjologii wchłaniania cukru, ale dostarczył nowych podejść do badania molekularnych mechanizmów sprzężenia między Na+ i transportem cukru przez błony plazmatyczne.

NOTY FOTOGRAFICZNE

• * Pierwszy z serii zaproszonych artykułów na temat genetycznych zaburzeń transportu membranowego.

.