1.4.3.2 Komary
Mosquitoes are vectors of serious human diseases such as malaria, dengue fever and yellow fever, and despite efforts to control them, they remain a serious problem. Oczekuje się, że identyfikacja nowych genów komarów zaangażowanych w węch, odżywianie krwią, trawienie, reprodukcję, odporność, itp., dostarczy podstaw do rozwoju nowych metod kontroli populacji komarów i chorób przenoszonych przez komary (Chen i in., Ostatnie informacje o sekwencji genomu trzech głównych wektorów komarów, Anopheles gambiae, Aedes aegypti, i Culex pipiens quinquefasciatus (http://www.vectorbase.org/), zostały wykorzystane do genomiki porównawczej i badań profilowania transkrypcji, które pozwalają na identyfikację dużych tablic nowych genów komarów. RNAi szybko stało się narzędziem z wyboru do charakteryzowania funkcji genów w różnych dziedzinach biologii komarów i interakcji komar-patogen (np. Fragkoudis i in., 2009). Doprowadziło to do opublikowania dość licznych badań funkcjonalnych RNAi w tej grupie organizmów, włączając członków aedines (A. aegypti, Armigeres subalbtus i C. pipiens) i anophelines (A. gambiae i Anopheles stephensi). Większość z tych badań koncentrowała się jednak tylko na dwóch gatunkach: głównym wektorze dengi i żółtej gorączki, A. aegypti, oraz afrykańskim wektorze malarii, A. gambiae (tabela 1.1).
W tych badaniach, typowa strategia eksperymentalna obejmowała mikroiniekcję dsRNA do tułowia dorosłych komarów, po czym następowało karmienie, poddawanie działaniu patogenów, środków zapachowych, insektycydów lub warunków stresowych, a następnie badanie komarów w celu przeanalizowania fenotypowego efektu wyciszenia ukierunkowanego genu na badany proces fizjologiczny, w tym na węch, karmienie, trawienie i metabolizm, stres, detoksykację, tworzenie kutikuli, reprodukcję, odporność i regulację diapauzy. W dalszej części przedstawiamy kilka reprezentatywnych badań RNAi u komarów.
Olfakcja pośredniczy w szerokim zakresie zachowań zarówno dorosłych jak i larwalnych komarów, włączając w to żerowanie, preferencje żywiciela, lokalizację/wybór partnera i miejsca lęgowe do składania jaj. Olfakcja obejmuje percepcję bodźców chemicznych dostarczanych przez cząsteczki odorantów i rozwój specyficznych odpowiedzi na te bodźce. Odoranty są wychwytywane przez białka wiążące odoranty (OBP), które transportują je do receptorów zapachowych (OR) na błonach dendrytycznych neuronów węchowych. Ostatnie badania RNAi ukierunkowane na geny OBP i OR dostarczyły cennych informacji na temat ich funkcji w mechanizmie i specyfice węchu (Biessmann i in., 2010; Liu i in., 2010; Pelletier i in, 2010), otwierając możliwość modyfikacji percepcji węchu i tym samym szeregu zachowań, które mogą skutkować zapobieganiem gryzieniu i kojarzeniu komarów.
W klimacie umiarkowanym, dorosłe samice komarów zimują w diapauzie, okresie uśpienia, który charakteryzuje się brakiem zachowań związanych z poszukiwaniem żywiciela, gromadzeniem ogromnych zapasów tłuszczu i zatrzymaniem rozwoju jajników. Manipulacja regulacją tego epizodu uśpienia może skutkować, na przykład, indukcją uśpienia komarów, które nie poszukują żywiciela. Przykładem tego jest kilka badań prowadzonych przez zespół dr Denlingera. W szczególności, ostatnio użyli oni RNAi do zbadania mechanizmu diapauzy u C. pipiens, aby udowodnić udział szlaku sygnalizacyjnego insulina/FOXO w regulacji diapauzy (Sim i Denlinger, 2008, 2009a). Mają oni również dowody na udział niektórych syntaz kwasów tłuszczowych w gromadzeniu rezerw tłuszczowych u zimujących samic (Sim i Denlinger, 2009b), a także na rolę białek rybosomalnych S3 i S2 w rozwoju pęcherzyków jajnikowych u niediapauzujących samic (Kim i Denlinger, 2010; Kim i in., 2010).
Witelogeneza i reprodukcja zostały również scharakteryzowane przez RNAi u komarów. Podobnie jak w przypadku kleszczy, komary anautogeniczne wymagają spożycia krwi kręgowców, aby zainicjować cykl reprodukcyjny obejmujący produkcję jaj. Aminokwasy (AA) pochodzące z posiłku krwi są wykorzystywane przez ciało tłuszczowe komara do syntezy prekursorów białka żółtka, głównie witellogeniny (Vg), w procesie zwanym witellogenezą. Vg jest następnie uwalniana do hemolimfy, pobierana przez jajniki i osadzana w rozwijających się oach poprzez specyficzny VgR.W komarze A. aegypti, ekspresja genu Vg była intensywnie badana przez zespół dr Raikhel w długiej serii eleganckich eksperymentów, w których używali RNAi jako narzędzia do odwróconej genomiki funkcjonalnej. Zespół ten wykazał, że transkrypcja genu Vg jest ściśle regulowana przez połączone wejścia kilku cząsteczek, w tym kaskady hormonu steroidowego 20-hydroksyecdysonu (20E) i sygnalizacji odżywczej AA/Target-of-Rapamycin (TOR). Ta serynowo-treoninowa kinaza jest odpowiedzialna za przekazywanie sygnału AA, aktywując fosforylację kinazy S6, która jest wymagana do aktywacji zdarzeń translacyjnych (Park i in., 2006; Roy i Raikhel, 2011). Ponadto, poprzez wstrzyknięcie specyficznego antagomiru, ten sam zespół wyprodukował RNAi-mediated deplecja miRNAi miR-27 w celu wykazania funkcji miR-27 jako pozytywnego regulatora zarówno w trawieniu krwi jak i rozwoju jaja. W rzeczywistości miR-27 per se jest regulowany przez szlaki 20E i AA/TOR (Bryant et al., 2010).
Wrodzony układ odpornościowy komarów-wektorów obejmuje trzy funkcjonalne kategorie genów zaangażowanych w rozpoznawanie patogenów, szlaki sygnalizacyjne pośredniczące we wzmacnianiu, modulacji i transdukcji sygnałów oraz mechanizmy efektorowe pośredniczące w usuwaniu patogenów z gospodarza (Baton et al., 2008). RNAi jest sam w sobie głównym antywirusowym mechanizmem immunologicznym u komarów. W odporności przeciwwirusowej opartej na RNA, wirusowe dsRNA jest rozpoznawane i przetwarzane na siRNA przez komara Dicer. Następnie, te pochodzące z wirusa siRNA kierują specyficzną odpornością przeciwwirusową poprzez RNAi i pokrewne mechanizmy efektorowe wyciszania RNA (Ding, 2010). Liczne prace donoszą o wykorzystaniu RNAi do scharakteryzowania funkcji genów odpornościowych komarów. Badania nad ogólnymi mechanizmami odpornościowymi i efektorami koncentrowały się na receptorach rozpoznawania wzorców, cząsteczkach antybakteryjnej i antygrzybiczej ścieżki sygnalizacyjnej oraz białkach zaangażowanych w inne komórkowe mechanizmy efektorowe (przegląd w Dong i in., 2006; Moita i in., 2005; Shin i in., 2003, 2006; Wang i in., 2006).
RNAi zostało również wykorzystane w charakterystyce interfejsu komar-patogen, a wiele badań dotyczyło cząsteczek komara związanych z układem odpornościowym. Molekularne interakcje na styku komar-patogen zapewniają przetrwanie i rozwój zarówno patogenu jak i wektora. Dlatego zrozumienie molekularnych interakcji pomiędzy patogenami i ich wektorami komarowymi jest fundamentalne dla rozwoju nowych środków kontroli. W ostatniej dekadzie, intensywne badania zostały podjęte w celu identyfikacji i funkcjonalnej charakterystyki genów komarów zaangażowanych w odpowiedzi immunologiczne wywołane patogenami, przy użyciu różnych metod, w tym genomiki porównawczej, profilowania transkrypcji i analizy funkcjonalnej opartej na RNAi (Baton i in., 2008). Wysiłki te koncentrowały się głównie na dwóch związkach komar-patogen, A. gambiae-Plasmodium sp. i A. aegypti-dengue virus 2 (DENV-2). Wrodzone odpowiedzi immunologiczne komarów na infekcje arbowirusowe zostały szczegółowo opisane przez Fragkoudis i wsp. (2009), a te na pasożyty malarii zostały ostatnio opisane przez Brown i Catteruccia (2006) oraz Baton i wsp. (2008), włączając w to metody RNAi.
Większość z tych badań opartych na RNAi było ukierunkowanych na geny z mechanizmów obrony immunologicznej komarów, a nie na geny potrzebne patogenom do rozwoju w wektorze komara. Jeśli chodzi o geny antymalaryczne komarów poddane knock-down RNAi, większość z nich jest zaangażowana w zabijanie ookinete i melanizację podczas penetracji midgut (przegląd w Brown i Catteruccia, 2006; Baton i in., 2008). Jeśli chodzi o geny przeciwwirusowe komara poddane knock-down, niektóre z nich są składnikami szlaków sygnalizacyjnych, podczas gdy inne stanowią część obrony przeciwwirusowej opartej na RNAi (przegląd w Fragkoudis i in., 2009).
Wśród najnowszych prac, Guo i in. (2010) prezentują użyteczne podejście do identyfikacji nowych białek A. aegypti oddziałujących z DENV-2. Autorzy ci opracowali pierwszy szkic sieci interakcji białek komara przy użyciu podejścia obliczeniowego i zidentyfikowali 714 przypuszczalnie związanych z DENV białek A. aegypti, które pogrupowali w cztery główne kategorie funkcjonalne (replikacja/transkrypcja/translacja, odporność, transport i metabolizm). Dziesięć z tych przypuszczalnych białek związanych z DENV zostało losowo wybranych do walidacji za pomocą wyciszania genów metodą RNAi, a miano wirusa dengi w trzewiach środkowych komarów zostało znacząco zmniejszone w przypadku pięciu z nich.
W sumie, wyniki te wspierają koncepcję, że RNAi może być potężnym narzędziem do wysokowydajnej charakterystyki systemu immunologicznego wektorów chorób owadów, przyczyniając się w ten sposób do identyfikacji i charakterystyki potencjalnych celów komarów dla rozwoju nowych metod kontroli populacji komarów, pasożytów w komarach i chorób przenoszonych przez komary.
Po odkryciu, że RNAi jest jednym z głównych mechanizmów obronnych komara przed arbowirusami, stwierdzono, że tłumienie tego szlaku zwiększa ładunek wirusowy u zakażonych komarów (Sanchez-Vargas i in., 2009). Cirimotich i wsp. (2009) wykorzystali wirusa Sindbis zmodyfikowanego w taki sposób, aby ekspresjonował białko, które wiąże się z dsRNA i przypuszczalnie chroni je przed przetwarzaniem w szlaku RNAi, działając w ten sposób jako supresor RNAi. Ten zmodyfikowany wirus produkuje znacznie więcej cząstek wirusa niż normalnie w zakażonych komarach i jest śmiertelny dla wielu gatunków komarów (A. aegypti, Aedes albopictus, C. trithaeniorhynchus). Podejście to jest przykładem nowego rozwoju opartego na genetyce, potencjalnie użytecznego w strategiach “tłumienia populacji” dla kontroli komarów (Alphey, 2009).
Odwrotny cel, czyli sztuczne wzmocnienie odporności przeciwwirusowej komarów opartej na RNAi w celu uzyskania komarów odpornych na wirusy, również został opracowany. Antywirusowe RNAi zostało wykorzystane do nadania odporności na DENV transgenicznym komarom A. aegypti, poprzez ekspresję RNA szpilki do włosów odpowiadającej fragmentowi wirusa (Franz et al., 2009). Przy użyciu tkankowo- i czasowo specyficznych promotorów, ekspresja RNA szpilki do włosów może być ograniczona do jelita środkowego – pierwszych zainfekowanych komórek – i tylko po spożyciu krwi, minimalizując potencjalne problemy dla kondycji komara wynikające z konstytutywnej ekspresji RNA o długiej szpilce do włosów. Dyskusja na temat zalet i problemów związanych z wykorzystaniem tego rodzaju transgenicznych, odpornych szczepów komarów w strategiach “zastępowania populacji” w celu kontroli komarów znajduje się w Alphey (2009).
.