Ammonium Acetate buffers pode causar vários problemas no laboratório. Dois problemas comuns incluem aumentos surpreendentes nas contra-pressões HPLC-MS ao iniciar o instrumento após o armazenamento noturno e dificuldades com a sensibilidade à EM.
A contrapressão aumentada do instrumento ao usar acetato de amônio (e forma de amônio) é um problema comum encontrado em fóruns de cromatografia, especialmente quando o instrumento estava de pé durante a noite ou nas primeiras corridas de cada dia. Tampões aquosos altamente solúveis podem causar uma grande quantidade de arranhões na cabeça. Eles se tornam problemáticos no uso prático, bloqueando capilares, pré-colunas e fritas analíticas.
Estes problemas resultam invariavelmente da má compreensão da solubilidade dos tampões em meios aquosos orgânicos mistos. Isto pode ser superado utilizando os dados mostrados na Figura 1.
Figure 1: Solubilidade de cinco tampões em misturas com acetonitrilo. (Adaptado com permissão da Ref. 1)
Figure 1 mostra claramente que a solubilidade do acetato de amónio em misturas binárias contendo mais de 90% de acetonitrilo é cada vez mais limitada na solubilidade, e totalmente insolúvel em 100% de acetonitrilo. Enquanto 20mM de acetato de amónio é o limite de solubilidade a 90% de acetonitrilo, este limite cai drasticamente para 10mM de acetato de amónio (uma popular concentração tampão usado com aplicações LC-MS) a 95% de misturas de acetonitrilo. Exceder estes limites de solubilidade resulta num líquido nublado devido ao fino precipitado de acetato de amónio dentro da solução. Isto pode bloquear capilares e fritas de coluna, causando um aumento na contrapressão do sistema. Deve-se também notar que os dados da Figura 1 são derivados usando uma solubilidade tampão de alta qualidade – a solubilidade diminuirá se forem usados reagentes de sal tampão de qualidade inferior (pureza). Evite tentar dissolver acetato de amónio em acetonitrilo puro, mesmo que a solução possa então ter água adicionada. Embora inicialmente possa parecer que o tampão é solúvel, ele irá rapidamente sair da solução (Figura 2).
Figure 2: Resíduo de acetato de amónio criado quando se ‘dissolve’ acetato de amónio em acetonitrilo, seguido pela adição de água para atingir a razão orgânica / aquosa necessária do eluente (Fotografia cortesia do Dr. Paul Ferguson, Astra Zeneca, UK).
Em um típico gradiente HPLC de fase reversa, isto talvez não seja tanto um problema, a menos, claro, que o seu gradiente vá para >90% de acetonitrilo. Entretanto, existem outras considerações, como as percentagens relativas de solvente orgânico que o tampão aquoso pode encontrar ao misturar usando sistemas de mistura de baixa ou alta pressão, ao injetar amostras dissolvidas em altas percentagens de acetonitrilo ou, no pior de todos os casos, quando os sistemas são lavados com 100% de acetonitrilo para remover os contaminantes da coluna ou para armazenamento durante a noite.
Existe a consideração adicional, quando se utiliza 100% de acetonitrilo para armazenamento em coluna, que grandes mudanças de pH podem ocorrer em solvente 100% orgânico e é preciso estar atento se essas mudanças de pH podem levar o pH de armazenamento em coluna a uma faixa onde a dissolução da matriz de sílica pode ser possível, levando à formação de ‘finos’ dentro da coluna que resultará, em última instância, em bloqueios de coluna (em pH alto) ou na remoção dos ligandos de fase colada (em pH baixo).
Ammonium Acetate as a Buffer
Muito optou por usar acetato de amônio como tampão, especialmente quando se usa a detecção de EM, devido a sua volatilidade inerente e baixa propensão para contaminação de fontes API. Entretanto, esteja atento a essa solubilidade limitada e ajuste nossa prática de HPLC de acordo. Entenda se o uso de acetato de amônia é apropriado para o experimento e se um tampão é realmente necessário. Os requisitos para uso e a escolha e concentração apropriada de um tampão são comumente mal compreendidos. O acetato de amónio é o caso em questão para investigar os usos e usos errados deste sistema tampão muito apreciado.
Buffers são necessários para resistir a pequenas mudanças no pH (principalmente do eluente) e para assegurar que a coluna de HPLC permaneça num estado de carga constante (principalmente o estado de ionização das espécies de silanol residual na superfície do suporte de sílica). Alterações no pH podem causar problemas com a estabilidade do tempo de retenção, forma dos picos e (quando se utiliza Electrospray MS) sensibilidade do instrumento. Tipicamente, o maior “desafio” para o pH do sistema virá da mistura do diluente da amostra com o eluente nos componentes conectivos entre o injetor e a coluna de HPLC (ou pré-coluna) e no topo da coluna. Se o diluente de amostra tiver um pH diferente, então a substância a analisar (ou uma porção das moléculas da substância a analisar) pode mudar o estado de ionização e o cromatógrafo de forma diferente ou responder de forma diferente na interface MS como resultado. Entretanto, é importante entender a química do nosso método analítico para fazer escolhas críticas sobre o tipo e concentração do tampão. As concentrações do analito e a quantidade de superfície da coluna que requer controle de pH são baixas o suficiente para necessitar apenas de uma concentração muito baixa de tampão para manter tempos de retenção reprodutíveis, forma de pico aceitável e sensibilidade de detecção.
Figure 3 indica as situações em que o acetato de amônia pode ser útil tanto na cromatografia quanto na espectrometria de massa.
Figure 3: Variação da capacidade tampão para solução aquosa de acetato de amónio (10mM) com várias proporções de acetonitrilo (%) (Adaptado com permissão da Ref. 2)
Essencialmente, existem duas regiões tampão quando 10mM de acetato de amónio é adicionado à nossa solução eluente, e ou diluir amónia ou ácido fórmico são usados para ajustar o pH. Sem a adição do ácido ou base, a solução terá muito pouca capacidade tamponante.
Em 100% solução aquosa, os valores de pKa tamponante são cerca de 4,8 e 9,5. O tampão é melhor utilizado em torno de +/- 1 unidade de pH da solução tampão pKa, onde a capacidade de tamponamento será reduzida para cerca de 66%. A 2 unidades de pH longe da solução tampão pKa, a capacidade tampão é reduzida para cerca de 5%. Para um tampão de acetato de amónio em água, o pH eluente utilizado para a separação deve ser de 3,8 a 5,8 quando se utiliza ácido fórmico como modificador de pH e 8,5 a 10,5 quando se utiliza amoníaco para ajustar o pH eluente. A advertência: uma vez que o acetonitrilo é adicionado ao sistema, este intervalo de trabalho muda e o intervalo de pH utilizável torna-se de 5,2 a 7,2 ou 7,9 a 9,9 a 60% de acetonitrilo. Para separações de gradiente, a pKa do sistema tampão mudará constantemente. A pKa do sistema na composição do gradiente inicial é usada para estimar a utilidade do tampão para a separação.
Estas faixas de pH serão suficientes para evitar mudanças na extensão da ionização do analito ou mudanças na protonação da coluna? Essa é a questão-chave.
Para a detecção de EM, os analitos ionogénicos na forma ionizada resultarão numa boa sensibilidade de detecção, ao mesmo tempo que se gere a retenção de fase inversa através de uma escolha criteriosa do tipo e composição da fase estacionária e do solvente orgânico. Se a substância a analisar for totalmente ionizada nas faixas de pH sugeridas acima (e na Figura 3), então resultará em bom desempenho cromatográfico e de detecção. Observe na Figura 1 que a capacidade tampão do sistema se reduz à medida que se adiciona acetonitrilo, com a capacidade tampão caindo para 30% do valor aquoso a 60% de acetonitrilo. O princípio chave com o uso de tampão no LC-MS é usar o mínimo possível para manter a reprodutibilidade do tempo de retenção, forma de pico aceitável, e sensibilidade do detector. A concentração de tampão influenciará diretamente a quantidade de supressão de íons encontrada e, portanto, a sensibilidade do método será diretamente afetada. Para manter uma boa capacidade de tamponamento com concentrações mais baixas de tampão, muitas vezes temos como objetivo trabalhar com +/- 0,5 unidades do tampão pKa.
Tabela 1 mostra as faixas de pH recomendadas nas quais os tampões de acetato de amônio serão úteis.
| % MeCN | Capacidade máxima tampão (ácido acético / acetato) | Capacidade máxima tampão (amónio / amónia) | Capacidade tampão (% em relação à solução 100% Aq) |
| 4.2 – 5.2 | 9.0 – 10.0 | 100 | |
| 20 | 4.7 – 5.7 | 8.7 – 9.7 | 80 |
| 40 | 5.0 – 6.0 | 8.5 – 9.5 | 50 |
| 60 | 5.6 – 6.6 | 8.3 – 9.3 | 302>306> |
Tabela 1: Faixas de trabalho de pH recomendadas e capacidades relativas indicativas de tamponamento para sistemas eluentes de acetonitrilo 0,1mM de acetato de amónio (aq) / acetonitrilo.
Utilizar as faixas de tampão da Tabela 1 para seleccionar o pH eluente no qual a substância a analisar deve ser 100% ionizada. Note que a concentração de tampão utilizada para derivar estes valores é 0,1mM – uma escolha popular para a concentração de tampão quando se utiliza a detecção de EM. Para analitos básicos, o sistema tampão ácido acético/acetato é comum, e o pH eluente está geralmente bem abaixo da pKa dos analitos básicos, garantindo que eles sejam constantemente protonados. O mesmo pode acontecer com os analitos ácidos com o sistema amônia/amônia, onde todos os analitos ácidos devem ser totalmente desprotonados. Isso garantirá que os tempos de retenção sejam estáveis, as formas de pico sejam saudáveis e que a sensibilidade à EM seja otimizada a partir de uma perspectiva química do método.
Existem grandes lacunas nas faixas de proteção eficazes para eluentes à base de acetato de amônia. Ou seja, com uma composição eluente de 20% de acetartílico (ou composição de gradiente inicial de 20% de acetonitrilo), é provável que haja uma menor capacidade tampão (será necessário utilizar concentrações tampão mais elevadas) com um pH eluente abaixo de 4,2, entre pH 5,2 e 9,0 ou acima de 10,0. Existem outros métodos onde o pH eluente é ajustado fora destes intervalos recomendados quando se utilizam tampões de acetato de amónio. Considere usar um sistema tampão diferente – o sistema ácido fórmico é uma escolha popular a valores de pH eluente abaixo de 4,2,
Devo um tampão ser sempre usado?
Se o pH eluente estiver longe da pKa do analito, pequenas mudanças no pH eluente terão um efeito insignificante no grau de ionização do analito. Sob estas circunstâncias, o uso de um tampão pode ser desnecessário. Por exemplo, ácidos acético (assim como fórmico, trifluoro e difluoroacético) têm uma capacidade substancial de ‘auto-campagem’ um pH baixo, e fornecem o analito básico pKa >2 unidades de pH mais alto e o analito ácido pKa
Isto tudo assumindo que os analitos básicos são analisados usando um sistema eluente ácido e analitos ácidos com um pH de sistema eluente mais básico para assegurar a ionização total e uma boa sensibilidade de MS de eletroospray. Se tiver problemas com a contrapressão do instrumento, instabilidade do tempo de retenção ou sensibilidade de detecção da EM, então pode valer a pena considerar se é necessário um sal tampão. O uso criterioso de ácidos fórmicos ou acéticos ou solução de amônia pode muito bem resolver quaisquer problemas.
Independentemente do caso, leve tempo para entender a química do método com relação ao seu analito pKa, o pH eluente necessário e a escolha do sistema tampão usado para atingir e manter esse pH dentro do sistema.
Para aqueles que não têm informações sobre o analito pKa, há uma série de programas gratuitos disponíveis que fazem um trabalho razoável de previsão do analito pKa com base na estrutura. Amplamente utilizados em nossos laboratórios são:
- ChemSketch – https://www.acdlabs.com/resources/freeware/chemsketch/
- MarvinSketch – https://chemaxon.com/products/marvin
Se estiver procurando um entendimento mais profundo sobre buffers e seu uso dentro do HPLC e LC-MS, consulte os artigos nas referências 3-6.
Solubilidade dos tampões em Eluentes Aquosos-Orgânicos para Cromatografia Líquida de Fase Inversa, Adam P. Schellinger e Peter W. Carr, LCGC North America Volume 22 Número 6 Junho 2004
Considerações sobre Tampão para LC e LC-MS, Xavier Subirats, Elisabeth Bosch, e Marti Rosés, LCGC North America Volume 27 Número 11 Novembro 2009
Tampão Móvel-Fase, Parte I – A Interpretação do pH em Fases Móveis Parcialmente Aquosas, LCGC North America Volume 20 Número 11 Novembro 2002
Tampões de Fase Móvel, Parte II – Seleção e Capacidade de Tampões, LCGC North America Volume 20 Número 12 Dezembro 2002
Tampões de Fase Móvel, Parte III – Seleção e Capacidade de Tampões, LCGC North America Volume 21 Número 1 Janeiro 2003
Tampões de Fase Móvel em LC: Effect of Buffer Preparation Method on Retention Repeatability, LCGC North America Volume 37, Edição 7, Julho 2019