3.1 Endogenous Fish Enzymes
Como discutido acima, várias enzimas proteolíticas são encontradas em vísceras, trato digestivo, e tecido muscular de peixes.
As maiores proteinases endógenas nas anchovas foram a tripsina proteinase, pepsina, quimotripsina, elastase, e aminopeptidase (Martinez & Serra, 1989; Siringan, Raksakulthai, & Yongsawatdigul, 2006). As enzimas digestivas da tripsina, quimotripsina e pepsina são consideradas como as três enzimas mais importantes em comparação com outras (de la Parra, Rosas, Lazo, & Viana, 2007). A pepsina é normalmente encontrada no estômago dos peixes e é a principal enzima dos sucos digestivos (de la Parra et al., 2007). A tripsina está presente em vísceras, cecas pilóricas e baço (Kishimura, Hayashi, Miyashita, & Nonami, 2005, 2006; Kishimura et al., 2007; Klomklao et al., 2006). Hepatopancreas de peixes e órgãos digestivos de crustáceos e moluscos contém atividades de peptidase e proteinase como aminopeptidase, proteases gelatinolíticas, tripsina e quimotripsina, e proteases colagenolíticas (Sriket, 2014).
Verificou-se que a maioria das atividades de lipólise e proteólise no processamento pediátrico foram registradas no intestino, especialmente no início do processo de fermentação; entretanto, as atividades caíram rapidamente durante o processo (Irianto, 1990). Considerando que as enzimas são encontradas nas vísceras e no trato digestivo, a evisceração tem um papel importante na determinação da taxa e do tipo de degradação enzimática que ocorre. Produtos de peixe fermentado processados usando o peixe inteiro terão características diferentes daqueles fabricados a partir de peixe descabeçado e eviscerado (Wheaton & Lawson, 1985). A actividade enzimática da maioria das enzimas viscerais e do tracto digestivo dos peixes teve a maior actividade a valores de pH quase neutros (Bougatef et al., 2007; Munilla-Moran & Saborido-Rey, 1996).
Castillo-Yañez, Pacheco-Aguilar, Garcia-Carreño, e Toro (2004) isolaram uma enzima proteolítica ácida, que pertence à classe da protease aspártica das vísceras da sardinha. A enzima é semelhante à pepsina II de outras espécies de peixes e é estável a pH 3-6 e 45°C.
A ceca pilórica representa os órgãos que são a principal fonte de proteinases alcalinas. Uma enzima semelhante à tripsina obtida da ceca pilórica do bacalhau (G. morhua) tinha um ponto isoelétrico de 5,30 e 5,89 e era muito semelhante em composição de aminoácidos à tripsina bovina, mas diferia em ter uma maior quantidade relativa de aminoácidos ácidos e uma menor quantidade de aminoácidos básicos. A enzima também hidrolisou substratos de proteína de peixe (Beirão, Mackie, Teixeira, & Damian, 2001).
Três proteinases alcalinas e duas proteinases ácidas foram isoladas da sardinha. Cada uma das proteinases alcalinas hidrolisadas caseína mais rapidamente do que outras proteínas. Uma grande protease alcalina (III) hidrolisada de proteínas sarcoplasmáticas a partir da sardinha cinco vezes mais rapidamente que outras proteinases alcalinas. Cada uma de duas proteínas ácidas hidrolisadas de hemoglobina e mioglobina mais rapidamente do que as outras proteínas. Após a préincubação com NaCl 25%, uma proteinase alcalina (III) e uma proteinase ácida (II) ficaram estáveis, embora as outras proteinases tenham se tornado instáveis. As duas proteinases, a alcalina proteinase III e a ácida proteinase II, também se mantiveram estáveis durante 3 meses após o início da produção do molho de peixe. A actividade proteolítica de cada uma das proteinases alcalinas e ácidas foi fortemente inibida por mais de 15% de NaCl; contudo, foi observada uma inibição mínima quando as proteínas do músculo da sardinha foram usadas como substrato (Noda, Van, Kusakabe, & Murakami, 1982).
Duas aminopeptidases (I e II) foram extraídas dos órgãos internos desengordurados da sardinha e purificadas por cromatografia DEAE-celulósica, filtração em gel em Sephadex G-200 e focalização isoelétrica. As preparações finais das enzimas I e II foram julgadas quase homogêneas por eletroforese de gel de poliacrilamida. Os pesos moleculares das enzimas I e II foram determinados pela filtração em gel como sendo de 370.000 e 320.000, respectivamente. Os pontos isoelétricos foram de 4,1 (I) e 4,8 (II), respectivamente. Ambas as enzimas foram inibidas por EDTA e ativadas por Co++. A Bestatin poderia inibir a enzima I, mas não a enzima II. As enzimas I e II hidrolisaram rapidamente não apenas substratos sintéticos contendo alanina ou leucina, mas também di-, tri-, e tetra-alanina. Com base em todas estas características, as sardinhas aminopeptidases assemelham-se à alanina-aminopeptidase humana. A enzima I reteve mais de 70% da sua actividade original em 15% NaCl, sugerindo que a enzima participa na hidrolização de proteínas e peptídeos de peixe durante a produção de molho de peixe (Vo Van, Kusakabe, & Murakami, 1983).
Atividades de proteínas alcalinas e ácidas foram comparadas com a tripsina e pepsina bovina e mostraram que, como a tripsina bovina, a proteinase alcalina da caseína hidrolisada de ceca da sardinha é mais efetiva que outros substratos proteicos (Noda et al., 1982).
Enzimas do tecido muscular, particularmente catepsinas, peptidases, transaminases, amidases, descarboxilases de aminoácidos, desidrogenase glutâmica, e enzimas relacionadas, são todas encontradas no tecido muscular do peixe (Chaveesuk, 1991), e estas enzimas, particularmente tripsina, quimotripsina, e catepsina, envolvem na hidrólise da proteína durante a fermentação do molho de peixe (Fernandes, 2016). As enzimas dos tecidos musculares estão, na sua maioria, localizadas nas células. Por outro lado, as enzimas digestivas são a secreção exocelular. Embora alguns estudos tenham mostrado que as enzimas do tecido muscular têm uma atividade ótima em pH neutro, a maioria dos relatórios informa que valores baixos de pH aceleram as atividades enzimáticas do tecido muscular. A maioria dos produtos fermentados de peixe são processados a pH acima de 4, excepto para silagem de peixe e alguns produtos fermentados de peixe. Consequentemente, a maioria das enzimas do tecido muscular não está na realidade na condição óptima de pH (Mackie et al., 1971).
Caracterização parcial das catepsinas B do músculo do carapau indicou características semelhantes com outras catepsinas BS. O pH ótimo da catepsina foi de 5 com temperatura ótima de 50°C. A atividade foi inibida por E-64, CA-074, e quimostatina (Yoshida et al., 2015).
Atividade máxima da enzima pode ser alcançada usando peixes inteiros incluindo cabeças e vísceras. Pelo contrário, a actividade enzimática mínima ocorrerá quando forem usados peixes decapitados e eviscerados para produzir produtos fermentados de peixe. Entretanto, a atividade enzimática intermediária pode ser obtida pela remoção das tripas a qualquer momento após a captura dos peixes para permitir alguma difusão de enzimas viscerais nos tecidos (Owens & Mendoza, 1985).
Em peixes salgados, o amadurecimento é descrito por três hipóteses. Estas são (1) teoria microbiológica, (2) teoria autolítica, e (3) teoria das enzimas. Na teoria microbiológica, os microrganismos produzem as enzimas activas essenciais, e estas enzimas penetram na carne e contribuem para o processo de amadurecimento. A teoria autolítica descreve que a maturação é resultado da actividade das enzimas dos músculos ou outros tecidos, ou do tracto gastrointestinal. Finalmente, a teoria enzimática explica a maturação dos peixes salgados como ocorrendo sob a influência de certas enzimas, nomeadamente, as contidas no tecido muscular, as dos órgãos do corpo intestinal dos peixes, juntamente com as produzidas por microrganismos (Mackie et al., 1971).
Na maturação das anchovas, a actividade autolítica máxima da anchova indiana (Stolephorus indicus) foi encontrada a 60ºC. A atividade autolítica diminuiu com o aumento da concentração de NaCl. O extrato bruto exibiu um pH ótimo a 8,5-9,5. As proteinases do tipo tripsina foram as proteinases predominantes no extracto bruto. As proteinases da anchova indiana podiam participar na hidrólise de proteínas durante a fermentação do molho de peixe. Portanto, a incubação da anchova indiana a 60°C e em 10% de NaCl durante um período de tempo antes da salga completa a 25% de NaCl poderia ser uma forma eficaz de acelerar o processo de fermentação do molho de peixe (Siringan et al., 2006).