Prática da classe

Medir o tempo necessário para que a amilase decomponha completamente o amido, retirando amostras a intervalos de 10 segundos e anotando o tempo em que a solução já não dá uma cor azul-negra com solução de iodo (mas a solução de iodo permanece laranja). Utilize tampões para fornecer soluções com pHs diferentes. Calcule a taxa desta reacção enzimática controlada calculando 1÷tempo.

Organização da lua

Este procedimento é suficientemente simples para ser realizado por indivíduos, se tiver covinhas suficientes. Se você optar por investigar cinco pHs, então grupos de cinco alunos poderiam completar a investigação trabalhando juntos e juntando os resultados.

Aparatus and Chemicals

Saúde &Segurança e notas técnicas

Solução de amilase e solução de iodo são de baixo risco uma vez que se compõem. Use proteção ocular ao manusear solução de iodo.
Perigos de tampões podem variar. Veja a ficha de receitas CLEAPSS ou informações do fornecedor e veja a Nota 3.

1 Amilase (Veja a ficha de receitas CLEAPSS) A enzima em pó é HARMFULO, mas soluções inferiores a 1% são BAIXO PERIGO. É aconselhável testar, com bastante antecedência, a actividade da enzima armazenada na sua concentração habitual de trabalho para verificar se os substratos estão decompostos a uma velocidade apropriada. As enzimas podem degradar-se no armazenamento, o que dá tempo para ajustar as concentrações ou para obter stocks frescos. A amilase perderá lentamente a atividade, por isso é melhor fazer um lote fresco para cada lição; os lotes podem variar em atividade e os resultados coletados em dias diferentes não serão comparáveis. A temperatura ótima para sua enzima será listada no rótulo do fornecedor.

Usar saliva: o Manual de Laboratório CLEAPSS fornece orientações sobre as precauções a tomar (incluindo precauções de higiene) para usar saliva com segurança como fonte de amilase. Isto tem a vantagem de ser mais barato, não exigindo técnicos para inventar soluções frescas a cada aula, é diretamente interessante para os alunos, e a amilase salivar é confiável. Também oferece uma oportunidade de ensinar boas precauções de higiene – incluindo assegurar que os alunos usem apenas suas próprias amostras de saliva (fornecer pequenos copos para cuspir); que os alunos sejam responsáveis por enxaguar seus próprios equipamentos; e que todos os vidros contaminados sejam colocados em uma tigela ou balde de clorato de sódio(I) antes da lavagem dos técnicos.

2 Suspensão de amido – faça fresco. Fazer um creme de 5 g de amido solúvel em água fria. Verta em 500 cm3 de água fervente e mexa bem. Ferva até ter uma solução límpida. Não utilize amido modificado.

3 Tampão: (Ver cartão de receitas CLEAPSS) Se fizer um tampão universal, este conterá hidróxido de sódio a aproximadamente 0,25 M, e deve ser rotulado como IRRITANTE. Consulte outros Perigos relevantes se optar por fazer outros tampões, ou a informação do fornecedor se comprar soluções tampão/ tabletes. (Nota 1)

4 Solução de Iodo (Veja CLEAPSS Hazcard e Recipe Card). Uma solução de 0,01 M é adequada para o teste de amido. Faça isto por diluição de 10 vezes a solução 0,1 M. Uma vez feita, a solução é de baixo risco, mas pode manchar a pele ou a roupa se derramada.

Perguntas éticas

Não há problemas éticos associados a este procedimento.

Procedimento

SAFETY: Todas as soluções, uma vez inventadas, são de baixo risco. Use proteção ocular, pois o iodo pode irritar os olhos.

Preparação

a Verifique a velocidade da reação com os volumes sugeridos de reagentes a serem utilizados – 2 cm3 de amido: 2 cm3 de amilase: 1 cm3 de tampão a pH 6. O ideal é que a reacção demore cerca de 60 segundos a este pH: este é o ideal habitual para a amilase (ver nota 1). Se a reacção for demasiado rápida, reduza o volume da enzima ou aumente o volume do amido. Se a reação for muito lenta, aumentar o volume ou concentração da enzima ou reduzir o volume ou concentração de amido.

Investigação

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b Coloque gotas individuais de solução de iodo em filas na telha.

c Marque um tubo de ensaio com o pH a ser testado.

d Use a seringa para colocar 2 cm3 de amilase no tubo de ensaio.

e Adicione 1 cm3 de solução tampão ao tubo de ensaio usando uma seringa.

f Use outra seringa para adicionar 2 cm3 de amido à solução amilase/ tampão, inicie o relógio de paragem e deixe-o ligado durante todo o ensaio. Misture usando uma pipeta plástica.

g Após 10 segundos, use a pipeta plástica para colocar uma gota da mistura na primeira gota de iodo. A solução de iodo deve ficar azul-escuro. Se a solução de iodo permanecer alaranjada, a reacção é demasiado rápida e o amido já foi decomposto. Esguiche o resto da solução na pipeta de volta para o tubo de ensaio.

h Espere mais 10 segundos. Depois retire uma segunda gota da mistura para adicionar à gota seguinte de iodo.

i Repita o passo h até que a solução de iodo e a mistura de amilase/ tampão/amido permaneçam cor de laranja.

j Pode preparar uma gota de controlo para comparação com as gotas de teste. O que deve conter?

k Conte quantas gotas de iodo você utilizou, cada uma igual a 10 segundos de tempo de reação.

l Repita todo o procedimento com outro dos buffers de pH a ser utilizado, ou junte os resultados da classe.

m Considere a coleta de dados de repetição se houver tempo.

n Faça um gráfico do tempo necessário para decompor o amido contra o pH, ou calcule a taxa de reação e plotar a taxa contra o pH.

Notas didáticas

Esta é uma prática simples, dando resultados confiáveis e sem ambigüidade. Os principais erros serão na ordem de mistura da enzima/ substrato/ tampão, ou um atraso na amostragem para que o tempo de reacção seja subestimado ou a taxa seja sobre-estimada. A variação de temperatura afeta a atividade enzimática, portanto os resultados coletados em dias diferentes não são comparáveis.

Saúde e segurança verificadas, setembro de 2008

Downloads

Download the student sheet Investigando o efeito do pH na atividade da amilase (72 KB) com perguntas e respostas.

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