Dr. Bang estava muito interessado em sistemas circulatórios invertebrados. Ele acreditava que estudar animais em que a circulação pudesse ser observada levaria a uma maior compreensão dos processos fisiológicos em vertebrados, como os humanos.
No início dos anos 50, enquanto ele estava no Laboratório Biológico Marinho em Wood’s Hole, Maine, Bang estudou o sistema circulatório do caranguejo-ferradura e sua resposta a infecções bacterianas.
Ele injetaria bactérias obtidas de água do mar fresca em caranguejos em ferradura de tamanhos variados e estudaria sua reação. Normalmente, o sangue formaria um pequeno coágulo para selar a área infectada e impedir que mais bactérias entrassem.
Mas um dia, Bang notou que um de seus caranguejos morreu de uma infecção desconhecida que causou a coagulação de quase todo o volume de sangue do caranguejo em uma massa semi-sólida.
Isso nunca tinha sido visto antes!
Então ele isolou e cultivou a bactéria do primeiro animal e a injetou em outros caranguejos ferradura. Eles também tiveram coagulação idêntica e morreram.
Investigando mais, ele descobriu que apenas bactérias “Gram-negativas” produziram esta reação.
Note: In 1884, Hans Christian Gram invented a staining procedure for microscopy which came to be called The Gram stain. It stains the bacteria either red (Gram-negative) or violet (Gram-positive) depending on the chemicals they have in their cell walls.
As bactérias Gram-negativas causam infecções como pneumonia e meningite. Quando o Bang matou a bactéria antes da injeção, ele ainda teve a mesma reação de coagulação. Isto significava que as bactérias vivas não eram necessárias para causar a coagulação do sangue do caranguejo ferradura.
Ele publicou suas descobertas em 1956 e deixou de lado suas observações iniciais por quase 10 anos.
Enter Jack Levin.
Em 1963, enquanto Bang discutia os dados do seu projecto do caranguejo ferradura, um colega sugeriu que colaborar com um hematologista poderia ajudar a desvendar o mistério da coagulação. O colega recomendou um pesquisador de seu laboratório, Dr. Jack Levin.
Levin estava usando coelhos para estudar a Reação Shwartzman – a reação a endotoxinas que causa a formação de um coágulo dentro de um vaso sanguíneo e também altera a função plaquetária dos vertebrados.
Endotoxina é um componente chave na parede celular de todas as bactérias Gram-negativas; pode ser difícil de detectar e é resistente a drogas.
Bang persuadiu Levin a passar um verão no Laboratório Biológico Marinho em Woods Hole onde ele estudou as semelhanças entre Limulus amebocytes e plaquetas humanas.
Ele rapidamente demonstrou que o plasma livre de células de um caranguejo ferradura não coagularia, mas quando ele estudou as células sanguíneas ele teve dificuldade em impedir que o sangue coagulasse.
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Ele estava tendo outro problema, também. Amostras que estavam bem quando ele saiu do laboratório à noite foram coaguladas quando ele voltou pela manhã, e nenhum dos anti-coagulantes no mercado fez diferença.
Serendipity Leads to an Aha! Momento
Levin ficou perplexo e ele estava ficando meio desesperado para descobrir isso!
Pode ser devido a bactérias ou algum componente de bactérias?
Para testar essa possibilidade, ele preparou novas amostras em vidro estéril, livre de endotoxinas. Surpreendentemente, o sangue não coagulou!
Foi quando ele percebeu que havia identificado um mecanismo de coagulação do sangue que foi desencadeado pela presença de endotoxina bacteriana gram-negativa.
Eventualmente, ele foi capaz de mostrar que todo o mecanismo de coagulação do sangue em Limulus estava contido nos amebócitos e era extremamente sensível à presença de endotoxinas.
Limulus polyphemus amebocytes
“Acho que apenas um investigador que estivesse trabalhando com endotoxina teria considerado a possibilidade de que a endotoxina estivesse causando a coagulação do sangue do Limulus”, diz Levin.
Isso levou Levin a criar e patentear o teste extremamente sensível do Lisado de Limulus Amebocyte (LAL), que poderia testar endotoxinas bacterianas usando sangue de caranguejo em ferradura.
O único outro teste para endotoxinas na época foi chamado de Teste de Pirogênio do Coelho. Na época, a US Food and Drug Administration exigia que todas as drogas injetáveis tivessem que passar no Teste de Pirogênio antes que pudessem ser aprovadas para uso.
No entanto, o Teste de Pirogênio do Coelho era um processo caro, ineficiente e muitas vezes impreciso.
Você injecta a amostra em um grupo de coelhos. Se os coelhos ficaram com febre nesses coelhos, a droga falhou no teste. Se eles não tiveram febre em 4-6 horas, passou.
As empresas farmacêuticas tiveram que alojar milhares de coelhos para realizar estes testes.
O teste LAL pode retornar um resultado em apenas 45 minutos e pode detectar a presença de endotoxinas em níveis inferiores a uma parte por trilhão.
Levin percebeu que ele teve um ensaio muito sensível e rápido! Esta foi uma dura competição para o teste do coelho.
O teste LAL pode retornar um resultado em apenas 45 minutos e pode detectar a presença de endotoxinas em níveis inferiores a uma parte por trilhão.
Embora o teste LAL tenha sido descrito pela primeira vez em 1965, levou quase 20 anos até o teste ser formalmente aprovado como um teste de endotoxina de produto final pela FDA!
Por que demorou tanto tempo?!
Sejamos realistas, as pessoas não gostam de mudar as coisas e as empresas resistem realmente às mudanças. Adoptar o novo teste, mais sensível, significava que as empresas farmacêuticas teriam de reequipar e montar uma nova linha de produção.
É tempo e dinheiro!
Mas o creme acaba por subir ao topo; este teste era o creme da colheita e ainda é!
A procura da LAL é agora tão elevada que se tornou um dos líquidos mais valiosos na Terra, com um preço reportado em Abril de 2018 entre 35.000 e 60.000 dólares por galão!
Aumentar o teste LAL
O teste LAL foi nomeado uma das “100 Contribuições Mais Importantes para a Saúde Pública” pela Escola de Saúde Pública Johns Hopkins Bloomberg.
De acordo com Jack Levin, é o teste de rastreio padrão para a contaminação por endotoxinas em todo o mundo, com aproximadamente 17,5 milhões de amostras testadas (totalizando cerca de 70 milhões de testes realizados) a cada ano. É usado comercialmente para testar todos os líquidos intravenosos, drogas parenterais e dispositivos médicos implantáveis antes de serem usados em pacientes.
Como é feito o LAL?
Caranguejos ferradura são capturados e um tubo é enfiado neles para sugar o sangue deles (veja a foto acima). Em seguida o sangue recolhido é centrifugado para concentrar os amebócitos. A adição de água aos amebócitos embalados faz com que se partam e libertam as proteínas de coagulação (o lisado) que reagem com as endotoxinas.
Esta forma de fazer LAL é tocada como um método não letal de obter sangue do caranguejo. Mas não é. Porque nem todos os caranguejos sobrevivem!
De acordo com a Comissão de Pesca Marinha do Estado do Atlântico, na sua Avaliação de Estoque de Caranguejo Ferradura de 2019 e Relatório de Revisão pelos Pares, 600.000 caranguejos ferradura são capturados e sangrados para satisfazer a procura anual de LAL.
Desses 600.000 caranguejos, aproximadamente 420-540.000 (70-90 %) sobrevivem ao procedimento. Juntamente com a invasão do habitat, aquecimento global e outros 500.000 + capturados e mortos todos os anos para serem usados como isco para a pesca de enguias e búzios e pode ver porque é que as populações de caranguejos ferradura estão a despencar.
Não só isso, mas os caranguejos são colhidos em Maio e Junho quando chegam a terra em manadas para acasalar, pôr os seus ovos e, esperemos, manter a sua sobrevivência.
Esta não é uma situação sustentável!
Existem melhores formas de fazer a LAL?
“O caranguejo-ferradura americano sobreviveu aos dinossauros e sobreviveu a quatro extinções em massa anteriores, mas está agora ameaçado pela indústria farmacêutica, comunidades piscatórias, perda de habitat, alterações climáticas e, mais recentemente, marés asfixiantes de algas vermelhas ao largo da costa leste dos Estados Unidos.”de Jonathan Watts em The Guardian
Existem dois esforços primários que estão sendo tocados como formas de mitigar esta infeliz situação.
Uma abordagem que está sendo tentada pela indústria farmacêutica é a aquicultura de caranguejos ferradura.
Inicialmente, as tentativas de cultivo de caranguejos ferradura não foram muito bem sucedidas. Parece que após 3-4 meses de cultivo, as concentrações de proteína hemolinfa caíram para níveis que resultam em mortalidade. Pensava-se que estas mortes estavam ligadas a deficiências nutricionais.
Dr. Anthony Dellinger é professor no departamento de neurociências da Universidade da Carolina do Norte em Greensboro e cientista da Kepley Biosystems Incorporated, Greensboro, NC.
Dellinger e KBI têm trabalhado arduamente no desenvolvimento de um novo e melhorado sistema de aquacultura. A sua premissa é que “a recolha controlada de LAL a partir de caranguejos ferradura monitorizados e bem conservados em aquacultura poderia aumentar as quantidades de fornecimento de LAL, assegurar a viabilidade das espécies e permitir novas inovações clínicas”
Se tivesse sucesso, produzir maiores volumes de LAL de forma fiável, sustentável e económica iria beneficiar tanto a natureza como a indústria.
Dellinger e colegas descreveram em detalhe como funciona o seu sistema de aquacultura num artigo publicado na Frontiers of Marine Science em Abril passado.
Vejamos os destaques e resultados desse estudo.
Primeiro, eles optimizaram um sistema de aquacultura de recirculação interior que mantém de forma fiável os caranguejos ferradura. O seu objectivo era facilitar a colheita repetitiva da LAL mantendo o bem-estar animal.
O próximo marco foi alcançar um método para a colheita repetitiva de baixo impacto. Para o fazer implantaram cirurgicamente um cateter no caranguejo-ferradura. Todos os seus testes mostraram que o caranguejo-ferradura tolerou muito bem estes cateteres.
Aqui está um resumo rápido dos seus resultados.
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Colheram e mantiveram 24 caranguejos durante um ano com 100% de sobrevivência. Os caranguejos em ferradura foram verificados quanto à actividade LAL, libertação de óvulos e espermatozóides e outros sinais que possam indicar uma deterioração da saúde. Não foram observados tais sinais.
Os caranguejos foram sangrados dos cateteres cerca de três vezes por mês o que potencialmente equivale a cerca de 36 sangramentos por caranguejo durante o período de 12 meses. Não foram encontrados problemas com os cateteres implantados durante este período de tempo.
Quando calcularam os custos incorridos, fora do layout inicial do sistema de aquacultura, a manutenção dos caranguejos chegou a cerca de $0.76 por libra, uma quantia muito acessível!
A questão mais importante que precisava de ser respondida era:
Como é que a LAL dos caranguejos ferradura mantidos internamente se compara com a obtida a partir de caranguejos recém colhidos?
Como mostrado na figura 6 do seu trabalho, não houve diferença significativa na actividade de coagulação da LAL endotoxina entre os caranguejos aquaculados e os selvagens. E também não houve uma diferença real na actividade das hemorragias dos dias 1, 16 e 23.
Estes resultados levaram-nos a concluir,
“…a aquacultura poderia corresponder às necessidades da indústria durante vários anos com o equivalente a 5-10% da captura anual de um ano, deixando quase 600.000 HSCs na natureza todos os anos a seguir. De facto, estes resultados sugerem que ∼60,000 HSCs de aquacultura poderiam ser sangrados de forma sustentável 12-24 vezes por ano e exceder a actual procura biomédica da LAL”
A segunda abordagem elimina completamente a necessidade de caranguejos.
Jeak Ling Ding, juntamente com o seu marido e parceiro de pesquisa Bow Ho, em Singapura, tinha um objectivo – eliminar completamente a necessidade de caranguejos em ferradura.
Ela estava a estudar Carcinoscorpius rotundicauda, uma espécie asiática que era muito menor que os caranguejos ferradura do Atlântico, e não podiam sangrar muito sem morrer.
A investigação da LAL levou à descoberta de que uma molécula chamada factor C era responsável pela sua acção de coagulação. Ding isolou o gene para o fator C e usou um vírus para inseri-lo nas células intestinais dos insetos. Isto essencialmente transformou os insectos em pequenas fábricas que produziam o factor C.
Os insectos modificados produzem quantidades suficientes de factor C, que poderia então ser vendido como recombinante* factor C (rFC) no mercado como um substituto viável para a LAL.
* Note: The word recombinant is a term used in molecular genetics to indicate a gene that has been isolated (cloned) and inserted into another organism's DNA so that organism makes the protein that gene specifies. Using a virus is one of many ways to accomplish this.
Então agora, ao invés de colher ou aquecer caranguejos ferradura e sangrá-los, eles poderiam cultivar grandes quantidades de insetos e isolar o rFC.
As empresas farmacêuticas que usaram o rFC confirmaram que ele funciona tão bem quanto a LAL e os custos de produção são comparáveis.
“Nós estávamos tão interessados como pesquisadores, tão felizes que ele está funcionando”, disse Ding. “E pensamos que o factor recombinante C seria adoptado em todo o mundo, e o caranguejo ferradura seria salvo”.
Felizmente, o rFC enfrentou os mesmos obstáculos à aceitação que a LAL enfrentou quando foi introduzido. Embora o rFC esteja no mercado desde 2003, tem sido lento a ganhar tracção. Mas pouco a pouco está ultrapassando os obstáculos para sua aprovação pela FDA. Originalmente apenas um fabricante o produzia – a empresa química sediada na Suíça, o Grupo Lonza.
Em 2013, a Hyglos GmbH tornou-se a segunda empresa a fazer rFC. Kevin Williams, um cientista sênior da Hyglos, diz que vê a aceitação e aprovação do rFC há muito tempo atrasada. Hyglos GmbH obteve aprovação para o seu uso por várias agências reguladoras européias.
Hoje, especialistas acreditam que, em última análise, o rFC se tornará o método dominante de detecção de endotoxinas, deixando os caranguejos ferradura completamente fora do gancho da produção industrial.
Agora isso é algo com que os caranguejos ferradura podem viver!
Note: In these times of COVID-19, I wouldn't be surprised to see the obstacles removed even faster. Taking and applying research knowledge to improve patient wellbeing is happening faster than ever before. And in cases like this, that's a really good thing!
O que nos leva à última pergunta que eu quero ver:
Por que nos importamos se os caranguejos ferradura sobrevivem, de qualquer forma?
Não são apenas relíquias antigas que o nosso ecossistema moderno poderia facilmente passar sem? Muitas outras espécies extinguiram-se e o planeta parece bastante bem.
É uma pergunta válida, por isso vamos investigar um pouco mais a fundo.
A resposta, “claro que os queremos salvar!” Temos criaturas suficientes neste planeta já ameaçadas ou que já se extinguiram. Nós simplesmente não podemos perder mais.
Como eu disse, isso é mais uma reação instintiva, não uma resposta que você pode pendurar seu chapéu. Para uma resposta melhor, precisamos ver como os caranguejos ferradura se encaixam no quadro geral.
Comecemos com o que comem e o que os come.
O caranguejo-ferradura adulto presa em pequenos moluscos como o mexilhão azul e a amêijoa do surf, e os vermes anelídeos.
A partir de 2017, os mexilhões azuis não correm perigo sério, de acordo com este relatório do The Safina Center na Universidade de Stony Brook. O mesmo é verdade tanto para os anélidos como para as amêijoas do surf.
Juvenis alimentam-se de pequenas partículas tanto de algas como de matéria animal. À medida que o animal cresce em tamanho, também cresce a presa que consome.
Em geral, parece que os caranguejos ferradura não estão tendo nenhum efeito prejudicial sobre suas espécies de presas.
Ok, esse é um dos lados da moeda. Que tal o outro? O que come caranguejo-ferradura?
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Ovas de caranguejo ferradura são uma fonte de alimento para muitos organismos.
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Estes incluem pássaros costeiros, alguns peixes – robalos listrados, mata-ratos listrados, silversides, linguados – assim como tartarugas marinhas, caranguejos, e búzios. São uma fonte de alimento crítica para 11 espécies de aves litorâneas migradoras. A perda destes ovos devastaria as populações destas aves.
As tartarugas marinhas e as aves costeiras como o nó vermelho dependem dos caranguejos-de-ferradura.
Milhares destas tartarugas migram para o Chesapeake e Delaware Bay no verão para se alimentarem dos caranguejos. Pensa-se agora que os cabeçudos sofrem de falta de caranguejos em ferradura no Chesapeake.
Poucas anedotas relatam que os caranguejos em ferradura aparecem em jacarés e barrigas de tubarão.
As crias de caranguejo-ferradura também podem ser um alimento chave na teia alimentar da costa. Durante o verão e o outono, os caranguejos ferradura, larvas e caranguejos em fase inicial de vida, se aglomeram nos baixios. Estes bocados são sem dúvida devorados pelos peixes e aves costeiras também.
E parece que existem muitos outros animais que os acham bastante palatáveis e que seriam difíceis de encontrar substitutos fáceis.
Para uma criatura que existe há 450 milhões de anos, nosso entendimento está longe de ser completo sobre o papel que Limulus polyphemus desempenha no ecossistema costeiro.
Com o estado atual de nosso conhecimento da ecologia do caranguejo-ferradura, não podemos definitivamente chegar a qualquer conclusão sobre o quão essencial é seu papel. O que podemos dizer é que eles definitivamente ocupam um nicho que merece um estudo mais sério.
Even então, eu estou descendo para o lado pela necessidade de conservá-los! É a minha atitude “mais vale prevenir do que remediar”. Só sabemos muito pouco para deixar uma espécie como Limulus polyphemus escapar por entre os dedos e desaparecer se pudermos evitá-lo.
Então, há alguma coisa que você possa fazer?
Se você mora perto de um lugar onde os caranguejos ferradura vêm para pôr ovos, é fácil de arremessar e ajudar. Existem programas de criação de caranguejos que dependem de voluntários.
E finalmente, lembre-se do caranguejo-ferradura quando for ao médico. Qualquer coisa injetada ou implantada em nosso corpo ainda está sendo testada quanto à contaminação bacteriana gram-negativa com LAL feita de sangue de caranguejo-ferradura.
Até a próxima vez
Rico
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Fontes de Informação Utilizadas para este artigo:
- O Caranguejo Ferradura
- Aquicultura do Caranguejo Ferradura como Fonte Sustentável de Testes de Endotoxina
- O Papel do Caranguejo Ferradura na Indústria Biomédica e as Tendências Recentes que Impactam a Sustentabilidade das Espécies
- Os Últimos Dias do Blue-Blood Harvest
- The Underwater Secrets of Horseshoe Crabs
- Este caranguejo pode salvar a sua vida – se os humanos não o eliminarem primeiro
- NJ terminou a sua colheita de caranguejos ferradura. Outros estados deveriam fazer o mesmo?
- O site do Caranguejo Ferradura criado por Kayla Westerlund
- O Caranguejo Ferradura do Atlântico