nos anos 60, dois marcos foram alcançados na fisiologia da absorção de açúcar intestinal. O primeiro foi a hipótese de cotransporte de Na+-glucose de Crane e colegas (1), que explicou o transporte ativo de açúcar, e o segundo foi a descoberta de má absorção de glicose e galactose (GGM) em pacientes (5, 6). A hipótese de cotransporte foi exaustivamente testada, confirmada e ampliada para incluir o “transporte ativo” de uma grande variedade de substratos em células, desde o acúmulo de lactose na Escherichia coli até o acúmulo de iodeto na glândula tireoide. Essencialmente, os cotransportadores são máquinas moleculares que utilizam a energia armazenada sob a forma de gradientes de potencial eletroquímico iônico através das membranas celulares, Na+ ou H+, para impulsionar o acúmulo de solutos específicos e água nas células (22). O cotransportador intestinal de Na+-glucose (SGLT1) usa Na+ e gradientes elétricos através da membrana para conduzir açúcar e água em enterócitos contra seus gradientes de concentração (9, 13, 23). A glicose e a galactose são ambas manipuladas pelo SGLT1, enquanto que a frutose é transportada através da borda da escova por seu próprio transportador privado, o transportador de frutose facilitado (GLUT5). Glicose, galactose e frutose completam sua viagem através da célula até o sangue através de outro transportador de açúcar facilitado (GLUT2) na membrana basolateral (Fig.1).

GGM é caracterizado pelo início neonatal de diarréia severa aquosa e ácida, que é fatal em poucas semanas, a menos que a lactose (glicose e galactose) seja removida da dieta (2). A diarréia cessa com o jejum ou a retirada dos açúcares ofensivos da dieta, mas rapidamente retoma com a alimentação oral de dietas contendo lactose, glicose ou galactose. A absorção da frutose não é afetada. Dados os sintomas da doença e o que se sabia na altura sobre a absorção de açúcar intestinal, previa-se que o GGM se devia a um defeito no cotransportador de Na+-glucose na fronteira da escova. Esta hipótese foi reforçada pelos requintados experimentos autorradiográficos de captação de galactose e ligação de clorizina feitos em biópsias de mucosas do primeiro paciente americano com GGM (17, 18). Estes experimentos mostraram que a redução no transporte de galactose foi associada a uma diminuição de 90% na ligação da ligação da clorizina à borda da escova. A clorizina é um inibidor específico, não transportado e competitivo do SGLT1.

O teste diagnóstico mais confiável para o GGM é o teste de respiração H2 (Fig.2). A administração oral de glicose ou galactose (2 g/kg) resulta em elevação do H2 no hálito muito acima de 20 partes/milhão em pacientes com GGM, mas sem tal aumento nos controles ou pacientes alimentados com frutose. Crianças com GGM prosperam “normalmente” nas fórmulas de reposição de frutose, mas os sintomas retornam mesmo na idade adulta com apenas uma colher de chá de glicose (6 g), e o teste de respiração H2 permanece positivo. A doença é bastante rara. Estamos cientes de cerca de 200 pacientes em todo o mundo, e uma grande proporção dos casos é de relações consanguíneas.

A fisiologia e a fisiopatologia da absorção de açúcar intestinal foram avançadas em 1987 por nossa clonagem do coelho cotransportador Na+-glucose por uma nova estratégia que chamamos de “clonagem por expressão”. Este sucesso foi rapidamente seguido pela clonagem de Turk e Hediger (4) do cotransportador humano de Na+-glucose e identificação por Turk et al. (20) da primeira mutação em um transportador para causar uma doença genética, o GGM. Obtivemos biópsias intestinais de duas irmãs diagnosticadas com GGM e amostras de sangue dos pais que são primos. Turk et al. (20) identificaram uma mutação homozigota, missense (Asp28Asn) no cDNA SGLT1 de cada irmã, descobriram que cada um dos pais era portador dessa mutação, e demonstraram que de fato a mutação aboliu completamente o transporte de Na+-glucose usando um ensaio de expressão de oócitos. Na mesma espécie, o rastreio pré-natal foi subsequentemente realizado em dois fetos e um (o irmão da probanda) foi encontrado como portador da mutação Asp28Asn e o outro (um primo) foi encontrado como sendo normal. Ambas as crianças prosperaram sem restrição alimentar e permaneceram assintomáticas por pelo menos dois anos (11).

Outros progressos foram inicialmente prejudicados pela dificuldade em obter amostras de biópsia de mucosas de crianças com GGM até que Turk et al. (21) conseguiram mapear todo o gene humano SGLT1. O gene é grande, com 15 exons distribuídos entre 72 kb de DNA. Uma vez seqüenciados os exons e suas regiões de flanco, foi desenvolvido um ensaio de polimorfismo conformacional de cadeia única para triagem de pacientes para mutações usando DNA genômico a partir de uma pequena amostra de sangue. Este desenvolvimento envolveu a amplificação da PCR de cada um dos 15 exons e suas junções intron-exon e eletroforese em gel dos produtos de PCR desnaturados para identificar exons portadores de mutações. Os exons anômalos foram então sequenciados. Para determinar se as mutações eram responsáveis pelo defeito no transporte de açúcar, foram expressos os mutantes nos oócitos de Xenopus laevis para os ensaios de absorção de Na+-glucose. Martı́n (Ref. 10, 12, e observações não publicadas) foi em grande parte responsável por esta fase do projeto. Foram identificadas mutações que explicam a doença em 33 dos 34 pacientes com GGM examinados. Os pacientes em 17 grupos de pacientes apresentaram mutações homozigotas e, em outros 10 grupos, os pacientes apresentaram mutações heterozigotas compostas. Estas incluíam 22 mutações de missense (ver Fig.3) e 4 mutações de splice-site e 3 mutações sem sentido que resultam na produção de uma proteína SGLT1 severamente truncada. A falha na detecção de mutações no 34º paciente pode ser porque a mutação estava na região promotora do gene, e o DNA desta área não foi incluído no procedimento de triagem.

Como fisiologista de transporte, tenho me interessado nas mutações de falta de GGM devido ao seu potencial na identificação de resíduos na proteína crítica para o transporte. Portanto, nós nos propusemos a determinar como as mutações de missense realmente causam o defeito no transporte de Na+-açúcar. Nesta abordagem, realizada em grande parte por Lostao (ver Refs. 10 e 12), as proteínas mutantes em X. laevisoócitos foram expressas e depois foram utilizados métodos biofísicos e bioquímicos para determinar o nível de proteína na célula e na membrana plasmática. Nos casos em que o transportador foi inserido na membrana plasmática, nós (7) examinamos as reações parciais do ciclo de transporte. Ficamos inicialmente desapontados ao descobrir que, com os primeiros 21 mutantes falhados estudados, o defeito primário era devido ao maltrato dos transportadores na célula. Com base nas florações ocidentais, todos os mutantes foram sintetizados em níveis semelhantes ou superiores aos do tipo selvagem SGLT. Entretanto, as medidas de carga (7) e a microscopia eletrônica de fratura de congelamento (24) da membrana plasmática do oócito demonstraram que houve uma grave redução no número de cotransportadores na membrana plasmática (10, 12). A julgar pelo grau de glicosilação do núcleo e complexo dos mutantes, o defeito no tráfico do SGLT1 para a membrana plasmática ocorreu entre o retículo endoplasmático e o Golgi ou o Golgi e a membrana plasmática. O erro de dobragem das proteínas mutantes pode ser a causa primária da falta de triagem do transportador (19). Em apenas um caso, o Gln457Arg, a proteína mutante na membrana plasmática do oócito estava próxima dos níveis normais.

Qual a relevância desses experimentos com oócitos para os intestinos de pacientes com GGM? Para responder a isso, examinamos (dados não publicados) a distribuição da proteína SGLT1 por imunocitoquímica nas biópsias mucosas de três pacientes com mutações homozigotos. Nos três, a distribuição das proteínas mutantes no oócito foi idêntica à distribuição da SGLT1 nos enterócitos do paciente: em dois a proteína estava no citoplasma, e em um a proteína estava na borda do pincel. Há também concordância entre nossos resultados sobre os oócitos e os obtidos por estudos autorradiográficos de biópsias do primeiro paciente americano com GGM (18). Stirling e seus colaboradores (18) descobriram que a ligação da clorizina à borda da escova do paciente foi reduzida em 90%, e não encontramos a proteína mutante SGLT1 (Cys355Ser e Leu147Arg) na membrana plasmática do oócito (10). Estes estudos sugerem que, pelo menos com estes quatro mutantes GGM, o oócito recapitula o comportamento da proteína mutante no enterócito.

Uma grande questão remanescente é como as mutações de falta distribuídas através da proteína (Fig. 3) perturbam o tráfico do transportador para a membrana plasmática. As respostas a esta pergunta são importantes na compreensão da biossíntese das proteínas da membrana plasmática e na concepção de melhores terapias para crianças com GGM.

A mutação de GGM em uma espécie, Gln457Arg, forneceu uma visão inestimável do mecanismo de transporte de açúcar. Lostao estudou (em preparação) o comportamento do Q457R SGLT1 expresso em oócitos e na mucosa intestinal do paciente e descobriu que a proteína é traduzida, glicosilada, e inserida na membrana plasmática, mas é incapaz de transportar açúcar. Na ausência de açúcar, a proteína mutante transporta Na+ pela via de fuga de Na+ ou Na+ uniport, e esta é bloqueada pela clorizina. A glicose também é um inibidor porque também bloqueia essa via de transporte de Na+, indicando que a glicose se liga ao Q457R SGLT1 mas não é transportada, ou seja, a mutação produz um defeito de translocação de açúcar. Panayotova-Heiermann e colegas (15) demonstraram independentemente que o “poro” de açúcar através do SGLT1 é formado pelo domínio terminal COOH do resíduo portador do SGLT1 Q457.

Para explorar estas observações examinamos o papel do Q457 na translocação de açúcar. Neste estudo, verificou-se que o mutante cisteína Q457C retém toda a actividade de transporte de Na+-glucose, para além de um aumento da constante aparente de glucose Michaelis-Menten (Km) de 0,4 para 6 mM, e que a mutagénese química de Q457C com reagentes carregados ou alquilantes neutros (metanetosulfonatos, MTS) bloqueia totalmente o transporte de açúcar. No entanto, como a proteína alquilada Q457C liga a glicose com uma constante de dissociação muito semelhante ao Km aparente para o transporte de açúcar pelo Q457C SGLT1, este resíduo não deve fazer parte do local de ligação do açúcar. A inibição do transporte de açúcar por Q457C pela MTS só ocorreu quando o cotransportador estava na conformação Na+ virada para fora, C2 (Fig.4). O reagente não foi eficaz na ausência de Na+, na presença de Na+ e glicose (ou clorizina), ou na presença de Na+ em potenciais despolarizados de membrana. Experiências de salto de tensão com rodamina Q457C também mostraram que o curso temporal e o nível de fluorescência seguiram de perto a transição do cotransportador entre as conformações C2 e C6 (Fig. 4). Interpretamos estes resultados para significar que o cotransportador pode existir em pelo menos três conformações diferentes (C6, C2 e C3) e que o acoplamento entre Na+ e o transporte de açúcar ocorre através de alterações conformacionais ligand e induzidas por tensão na proteína.

Estudos preliminares com duas outras mutações de falta de GGM no domínio terminal COOH do SGLT1, A468V e R499H (Fig. 3), mostram que a substituição dos resíduos por cisteína restaura o tráfico da proteína para a membrana plasmática do oócito. Ambas as proteínas são funcionais, e o transporte de açúcar é bloqueado por reagentes MTS. Como no caso do Q457C, esses resíduos só são acessíveis aos reagentes MTS quando as proteínas estão na conformação C2. Estes resultados apoiam a minha visão de que as hélices transmembrana 10-13 (Fig. 3) formam o poro do açúcar. Mais trabalho é necessário para identificar o poro Na+.

Em resumo, estudos de biologia molecular sobre SGLT1 levaram à clonagem do cDNA para o SGLT1 humano e ao mapeamento do gene, que forneceram novas e poderosas ferramentas para examinar a fisiologia do transporte de Na+-glucose e para estudar a GGM. O GGM foi confirmado como sendo devido a mutações no gene SGLT1, e a maioria dessas mutações resulta ou na proteína SGLT1 truncada ou no maltrato do transportador na célula. Como previsto para uma doença autossômica recessiva, uma mutação privada produz a doença em cada espécie e a freqüência da doença aumenta em culturas com uma alta freqüência de casamentos consanguíneos. Embora o GGM seja raro, é possível que o maior grupo de indivíduos portadores de mutações leves de SGLT1, ou mutações graves em um alelo, tenha prejudicado a absorção de glicose e galactose. Cerca de 10% da população normal, estudantes de medicina, fizeram testes positivos de glicose H2 no ar expirado (14). Essa interface entre fisiologia e doença não só aumentou a compreensão da fisiopatologia da absorção de açúcar, mas também proporcionou novas abordagens para estudar os mecanismos moleculares do acoplamento entre o Na+ e o transporte de açúcar através das membranas plasmáticas.

FOOTNOTES

• * Primeiro de uma série de artigos convidados sobre Distúrbios Genéticos do Transporte de Membranas.