ImunohistoquímicaEditar

Immunohistochemistry or IHC staining of tissue sections (or immunocytochemistry, which is the staining of cells), is perhaps the most commonly applied immunostaining technique. Enquanto os primeiros casos de coloração de IHC usavam corantes fluorescentes (ver imunofluorescência), outros métodos não fluorescentes usando enzimas como a peroxidase (ver coloração de imunoperoxidase) e a fosfatase alcalina são agora usados. Estas enzimas são capazes de catalisar reacções que dão um produto colorido que é facilmente detectável por microscopia de luz. Alternativamente, elementos radioativos podem ser usados como etiquetas, e a imunoreação pode ser visualizada por autoradiografia.

Preparação ou fixação do tecido é essencial para a preservação da morfologia celular e da arquitetura dos tecidos. A fixação inapropriada ou prolongada pode diminuir significativamente a capacidade de ligação de anticorpos. Muitos antígenos podem ser demonstrados com sucesso em cortes de tecido com fixação em parafina. Entretanto, alguns antígenos não sobreviverão nem mesmo a quantidades moderadas de fixação de aldeídos. Nessas condições, os tecidos devem ser rapidamente congelados em nitrogênio líquido fresco e cortados com um criostato. As desvantagens das secções congeladas incluem má morfologia, má resolução a maiores aumentos, dificuldade em cortar sobre secções de parafina, e a necessidade de armazenamento congelado. Alternativamente, as secções vibratómicas não requerem que o tecido seja processado através de solventes orgânicos ou calor elevado, o que pode destruir a antigenicidade, ou interrompido pelo descongelamento por congelamento. A desvantagem das secções vibratómicas é que o processo de seccionamento é lento e difícil com tecidos macios e mal fixados, e que as marcas de tagarelice ou linhas vibratómicas são frequentemente aparentes nas secções.

A detecção de muitos antigénios pode ser dramaticamente melhorada por métodos de recuperação de antigénios que actuam quebrando algumas das ligações cruzadas de proteínas formadas pela fixação para descobrir sítios antigénicos escondidos. Isto pode ser conseguido através do aquecimento por períodos variados (recuperação de epitopos induzidos pelo calor ou HIER) ou usando a digestão enzimática (recuperação de epitopos induzidos por proteolíticos ou PIER).

Uma das principais dificuldades com a coloração de IHC é a superação de fundo específico ou não específico. A optimização dos métodos e tempos de fixação, o pré-tratamento com agentes bloqueadores, a incubação de anticorpos com elevado sal, a optimização dos tampões de lavagem pós-anticorpos e dos tempos de lavagem são todos importantes para a obtenção de imuno-coloração de alta qualidade. Além disso, a presença de controles positivos e negativos para coloração são essenciais para determinar a especificidade.

Citometria de fluxoEditar

Um citômetro de fluxo pode ser usado para a análise direta de células que expressam uma ou mais proteínas específicas. Células são imunossemitidas em solução usando métodos similares aos usados para imunofluorescência, e então analisadas por citometria de fluxo.

Citometria de fluxo tem várias vantagens sobre IHC, incluindo: a capacidade de definir populações de células distintas pelo seu tamanho e granularidade; a capacidade de gate out de células mortas; melhoria da sensibilidade; e análise multicolorida para medir vários antígenos simultaneamente. Entretanto, a citometria de fluxo pode ser menos eficaz na detecção de populações celulares extremamente raras, e há uma perda de relações arquitetônicas na ausência de uma seção tecidual. A citometria de fluxo também tem um alto custo de capital associado com a compra de um citômetro de fluxo.

Western blottingEdit

Western blotting permite a detecção de proteínas específicas de extratos feitos de células ou tecidos, antes ou depois de qualquer etapa de purificação. As proteínas são geralmente separadas por tamanho usando eletroforese em gel antes de serem transferidas para uma membrana sintética através de métodos secos, semi-secos, ou blotting úmido. A membrana pode então ser sondada usando anticorpos usando métodos similares à imunohistoquímica, mas sem a necessidade de fixação. A detecção é tipicamente realizada usando anticorpos ligados à peroxidase para catalisar uma reação quimioluminescente.

Western blotting é um método de biologia molecular de rotina que pode ser usado para comparar semi-quantitativamente os níveis de proteína entre extratos. A separação de tamanho antes do blotting permite que o peso molecular da proteína seja medido em comparação com marcadores de peso molecular conhecidos.

Enzyme-linked immunosorbent assayEdit

O ensaio de imunoabsorção enzimática ou ELISA é um método diagnóstico para determinar quantitativa ou semi-quantitativamente as concentrações proteicas do plasma sanguíneo, soro ou extractos de células/tecidos num formato de placa multipoços (normalmente 96 poços por placa). Em geral, as proteínas em solução são adsorvidas às placas ELISA. Os anticorpos específicos para a proteína de interesse são usados para sondar a placa. O fundo é minimizado através da optimização dos métodos de bloqueio e lavagem (como para IHC), e a especificidade é assegurada através da presença de controlos positivos e negativos. Os métodos de detecção são normalmente baseados em colorimetria ou quimioluminescência.

Imuno-electron microscopyEdit

Electron microscopy ou EM podem ser usados para estudar a microarquitectura detalhada dos tecidos ou células. Imuno-EM permite a detecção de proteínas específicas em seções de tecidos ultrathin. Os anticorpos rotulados com partículas de metais pesados (por exemplo, ouro) podem ser visualizados diretamente usando microscopia eletrônica de transmissão. Embora poderoso na detecção da localização sub-celular de uma proteína, o imuno-EM pode ser tecnicamente desafiador, caro e requer uma optimização rigorosa dos métodos de fixação e processamento dos tecidos. A biotinilação da proteína in vivo foi proposta para aliviar os problemas causados pela frequente incompatibilidade da coloração de anticorpos com protocolos de fixação que melhor preservam a morfologia celular.