Clostridium botulinum – Botulism (Formas clínicas). Testes para o diagnóstico do botulismo. Detecção de toxinas em pacientes, alimentos, rações, lodos ou sedimentos aquáticos; aves aquáticas, outras amostras. Testes recomendados: toxina de detecção, C. botulinum culture, Typed botulinum toxin; Molecular diagnosis (PCR).
Characteristics of Clostridium botulinum and botulinum toxin/s
Clostridium botulinum is an strict anaerobic grampositive bacillus, genus Clostridium, família Clostridiaceae, spore-forming, that produces a neurotoxic toxin. Esta bactéria é geralmente encontrada no solo e água doce e sedimentos não tratados (oceanos, lagos), com uma distribuição mundial. Em algumas circunstâncias este organismo pode contaminar os alimentos e crescer neles para produzir a(s) sua(s) toxina(s). O botulismo, uma forma grave de intoxicação alimentar, resulta da ingestão de alimentos que contêm a toxina. Embora esta doença seja rara, a sua taxa de mortalidade é elevada. Quando o tipo de toxina foi determinado entre 1036 casos detectados nos EUA entre 1899 e 1990, 384 foram para a toxina A, 106 devido à toxina B, 105 para a toxina E e 3 para a toxina F. Algumas vezes podem ser casos devidos a duas toxinas, por exemplo A e B.
Todas as formas de botulismo humano ou animal, são causadas pela absorção da toxina botulínica formada durante a multiplicação da bactéria Clostridium botulinum. A toxina tem uma toxicidade (neurotoxicidade) muito elevada, pelo que exerce a sua acção a níveis extremamente baixos, é termolábil, enquanto que os esporos das bactérias são resistentes ao calor e sobrevivem em alimentos aquecidos a mais de 100ºC, como os enlatados sob tratamento térmico. Além disso, algumas cepas de C. botulinum, C. butyricum, C. baratii e C. argentinense podem produzir neurotoxinas botulinum.
Existem sete tipos de toxinas (A – G) diferenciáveis por testes de neutralização, úteis para a clínica e epidemiologia. Os tipos A, B, E e F são as principais causas do botulismo humano, enquanto os tipos C e D são encontrados em casos de botulismo animal, sendo os mais afetados as aves silvestres e aves de capoeira, gado, cavalos e algumas espécies de peixes. Os tipos A e B são os mais comuns nos homens e estão principalmente relacionados com a contaminação de vegetais enlatados caseiros, mas na Europa estes tipos também têm sido encontrados em relação aos produtos de carne. O tipo E (peixe) encontrado em ambientes aquáticos e correlacionado com casos de botulismo E relativos a peixes ou mariscos contaminados, está a aumentar. O tipo F é excepcional. O tipo C está subdividido em C1 (neurotoxina) e C2 (não neurotoxina afecta a permeabilidade vascular e enterotoxigénica). O tipo G é produzido por C. argentiniense (isolado do solo na Argentina, soro de pacientes falecidos, embora não esteja claro seu envolvimento).
Toxinas são sintetizadas durante o crescimento da bactéria como uma proteína inativa (150 kDa), que é liberada da bactéria durante a lise. Para ativar a toxina formada deve degradar em duas cadeias de polipeptídeos (50 e 100 kDa).
C. botulinum, pode se diferenciar em grupos de acordo com suas características de cultura, bioquímicas e fisiológicas. Todas as culturas do tipo A e algumas do tipo B e F, são proteolíticas. Culturas de toxinas C. botulinum produzidas por C e D não são proteolíticas, quando cultivadas num meio com clara de ovo coagulada ou carne. Todos os tipos E e alguns dos tipos B e F são não-proteolíticos, mas têm características de metabolismo de carboidratos que diferem dos grupos não-proteolíticos tipos C e D. As cepas do tipo G não têm sido estudadas com detalhe suficiente para uma caracterização eficaz e satisfatória.
A temperatura ótima para o crescimento e produção de toxinas é de cerca de 35ºC para as cepas proteolíticas; para as cepas não-proteolíticas é de 26-28ºC. As estirpes não-proteolíticas dos tipos B, E e F podem produzir toxinas a temperaturas de refrigeração (3-4ºC). As toxinas das estirpes não-proteolíticas não apresentam toxicidade máxima até à toxina activada com tripsina. As toxinas de cepas proteolíticas são geralmente produzidas na sua forma ativada.
Formas clínicas de botulismo
Existem quatro formas clínicas de botulismo humano:
- Intoxicação alimentar (botulismo alimentar), devido à ingestão de alimentos contaminados com Clostridium botulinum nos quais a toxina é formada.
- Botulismo de ferida, produzido pela infecção da ferida com Clostridium botulinum e desenvolvimento de toxina in vivo após o crescimento da bactéria na ferida.
- Botulismo informativo, produzido pela produção de toxina no tracto digestivo de crianças pequenas colonizadas por Clostridium botulinum (a causa mais comum é devido à ingestão de mel ou xarope de milho contaminado), seguido da absorção da toxina. Estes pacientes podem ter anticorpos para a toxina.
- Botulismo intestinal adulto, causado pela colonização digestiva por Clostridium botulinum em idosos, seguido pela absorção da toxina. Estes pacientes podem ter anticorpos para a toxina.
Em qualquer uma das formas clínicas de botulismo humano, e igual no botulismo animal, a toxina penetra no sangue do trato gastrointestinal quando ingerida pré-formada com um alimento, ou quando produzida pela bactéria que coloniza o trato digestivo (crianças pequenas ou adultos), ou em casos excepcionais crianças de uma ferida infectada com a bactéria. Existem alguns alimentos que são mais propensos do que outros a conter toxina botulínica. Os alimentos com um pH inferior a 4,5 são mais difíceis de serem causa de botulismo, uma vez que a este pH C. botulinum é incapaz de se multiplicar e produzir toxina (é o caso de sucos de fruta, alimentos marinados com vinagre, etc.). Pelo contrário, alimentos com pH igual ou superior a 4,5 podem causar botulismo, já que neles é possível a multiplicação e produção de toxinas (é o caso da carne, peixe, vegetais, pratos preparados, etc.), em todos esses alimentos exposição livre de oxigênio, como nos alimentos enlatados ou embalados a vácuo, e com um pH superior a 4,6. São exemplos de alimentos perigosos: presunto curado, fumado, peixe enlatado ou vegetal (sujeito a tratamento térmico insuficiente para matar esporos), etc. As latas contaminadas com C. botulinum são geralmente curvadas, embora isto não ocorra com o tipo E.
A toxina absorvida liga-se irreversivelmente às junções neuromusculares dos neurónios motores, impedindo a libertação de acetilcolina e causando paralisia flácida ou fraqueza muscular.
Clinicamente é caracterizada por paralisia flácida aguda, que geralmente começa com o envolvimento bilateral dos nervos cranianos, afetando os músculos da face, cabeça e faringe, e depois desce simetricamente para afetar os músculos do peito e membros. A morte, quando ocorre, é devida à insuficiência respiratória por paralisia da língua e dos músculos faríngeos ocluindo as vias aéreas superiores, ou por paralisia do diafragma e dos músculos intercostais. Por este motivo, os pacientes devem receber antitoxina botulínica e cuidados intensivos respiratórios necessários.
Testes de diagnóstico para botulismo
Detecção de toxina botulínica em amostras ou alimentos sem cultura (ver amostra recomendada na secção de testes “Teste oferecido pelo IVAMI e amostras necessárias”).
Isto é recomendado em um paciente com evidência clínica de botulismo.
Detecção da toxina botulínica pode ser realizada num líquido como o soro obtido a partir de sangue. Também pode ser detectada a partir dos restos de alimentos ingeridos que tenham causado um caso ou um surto de botulismo. Para realizar o teste usando restos de alimentos é necessário obter um filtrado de extracto do mesmo. Em casos de botulismo infantil ou botulismo intestinal pode ser detectada a presença de toxinas nas fezes de crianças ou pacientes, mas considera-se mais aconselhável a realização de uma cultura preliminar de fezes (ver abaixo ). A detecção de toxina botulínica em qualquer dos casos é realizada por inoculação em micethat que desenvolvem sintomas paralíticos, seguido de morte, se inoculado com toxina botulínica. Para confirmar que os ratos morreram devido à toxina botulínica inoculada, é necessário um teste de neutralização, que confirma a presença da toxina botulínica e identifica o tipo de toxina botulínica presente. Este teste de neutralização é realizado frente ao produto inoculado (soro de pessoa ou animal, extrato de alimento ingerido, …) a anti-soros específicos de cada tipo de toxina.
Prior à etapa do teste de neutralização é necessário calcular a dose mínima letal (MLD). Assim, calculamos a diluição máxima (maior) que causa a morte dos animais infectados, sendo que o volume inoculado causou a morte dos animais contendo uma dose mínima letal (LMD).
Para identificar o tipo de toxina, uma vez conhecida a “dose mínima letal”, esta é confrontada com diferentes anti-toxina botulínica tipo anti-soro. Estas misturas serão inoculadas em volume igual a ratos experimentais e aqueles que sobrevivem, foram inoculados com a mistura de “dose mínima letal” mais anti-soro a um tipo que foi capaz de neutralizar.
Detecção de toxina em amostras / produtos após a pré-cultura (ver Amostra recomendada após no teste oferecido pelo IVAMI e amostras necessárias).
Quando a bactéria Clostridium botulinum, que produz a toxina, pode ser encontrada na amostra é recomendado o cultivo prévio, para investigar a toxina após ter cultivado a amostra. Este é o caso das fezes de um paciente com botulismo infantil ou botulismo intestinal, os restos de alimentos ingeridos nos quais se proliferaram bactérias (e.gr., pode prerservas), um alimento suspeito que pode conter as bactérias (e.gr., uma conserva inchada), um alimento sob controlo para excluir a presença desta bactéria (e.gr., pode prerservas), salsichas, presuntos, latas), ou outras amostras, tais como lamas de água doce ou sedimentos marinhos aquáticos, etc., de áreas onde foi observada mortalidade em aves aquáticas.
Cultura em laboratório, em meios de cultura adequados, a toxina é produzida se houver uma bactéria e a obtenção de um filtrado de cultura pode ser útil para investigar a sua presença, inoculando o filtrado em ratos. Se os ratos inoculados forem afectados indicam a provável presença de Clostridium botulinum na amostra ou o crescimento em cultura. Entretanto, camundongos podem ter morrido por outra causa, então é necessário, antes de emitir o relatório, verificar se eles realmente morreram por terem sido inoculados com toxina botulínica.
Para confirmar a presença de toxina botulínica nos testes de neutralização de cultura usando anti-soros específicos para cada tipo de toxina botulínica (teste de neutralização) pode ser realizado, ou a detecção da presença de genes de Clostridium botulinum e seu tipo no meio de cultura (detecção molecular por PCR).
O teste de neutralização é realizado frente à amostra inoculada (filtrado de cultura) para anti-soros específicos para cada tipo de toxina.
Prior à etapa do teste de neutralização é necessário calcular a dose mínima letal (MLD). Assim, calcula-se a (maior) diluição máxima que causa a morte dos animais inoculados, e o volume inoculado causou a morte dos animais contendo uma dose mínima letal.
Para identificar o tipo de toxina, uma vez conhecida a “dose mínima letal”, confrontar a dose mínima letal com diferentes tipos de soros anti-botulínicos é realizado. Estas misturas serão inoculadas em volume igual a ratos experimentais e aqueles que sobreviverem, foram inoculados com a mistura de “dose mínima letal” mais anti-soro a um tipo que tenha sido capaz de neutralizar.
A detecção molecular por PCR evita o tempo necessário para calcular a dose mínima letal (MLD) e o teste de neutralização.
Detecção de anticorpos anti-toxina botulínica (ver amostra recomendada após na secção Teste oferecido pelo IVAMI e amostras necessárias)
- Patientes tratados com toxina botulínica diluída, tais como os que recebem botox para tratamentos estéticos ou médicos (e. gr. dor devido à neuralgia do trigêmeo facial), para detectar a presença de anticorpos que impedem a sua ação.
- Patientes com suspeita de botulismo infantil ou botulismo adulto que não tenham sido capazes de encontrar a bactéria Clostridium botulinum toxina nas fezes ou no soro.
- Pessoas vacinadas que estejam interessadas em verificar o estado de protecção.
Toxina Clostridium botulinum, em diluições muito elevadas, tem sido usada pela administração local para tratar processos espásticos. Estes processos têm demonstrado ser um remédio útil. Estes processos são geralmente espásticos crónicos, exigindo assim que a toxina seja administrada permanentemente. Portanto, a resistência pode surgir durante o tratamento devido à imunização progressiva do paciente durante todo o tratamento, caso em que o efeito seria limitado. Para detectar esta imunização é necessário medir com precisão e sensibilidade a existência de anticorpos contra a toxina botulínica A e/ou B.
O método de referência aceite para detectar e quantificar anticorpos contra a toxina botulínica é o teste de neutralização em ratos (Mouse Neutralization Assay), no qual uma diluição da toxina botulínica, quantificada pela Dose Letal 50% para rato (DL50), misturada com várias diluições de base 2 ou base 4 do soro/plasma, e após a incubação cada uma é inoculada intraperitonealmente a grupos de ratos. A maior diluição do soro de teste que reduz a toxicidade corresponde ao título de anticorpos contra a toxina botulínica correspondente. Esta diluição, comparada com um padrão internacional, permite obter resultados em unidades internacionais (IU/mL) (1 IU é definida como a quantidade de anticorpos que neutraliza 10.000 LD50 de toxinas A ou B, ou 1000 LD50 tipo E). A quantidade de toxina utilizada nos testes é aquela que é neutralizada por 0,02; 0,005 e 0,0125 UI/mL de antitoxina para os tipos A, B e E, respectivamente (Hatheway et al. 1984). Os soros que protegem o título de 1: 4 são relatados como <0,08 UI/mL para tipo A, ou <0,02 UI/mL para tipo B. O teste é trabalhoso, caro e de longa duração, por isso foram procuradas alternativas aos métodos baseados em enmzimoinmunoanálise (ELISA) usando microplacas revestidas com toxina botulínica. Entretanto, os valores obtidos pelo ELISA às vezes não se correlacionam totalmente com o teste de neutralização em ratos.
Prior à etapa do teste de neutralização é necessário calcular a dose mínima letal (DLM) de toxina. O cálculo da dose mínima letal é realizado por diluições base 10 do filtrado da cultura, diluindo metade com soro fisiológico para obter a mesma diluição que a toxina misturada com soro ou plasma do paciente, e inoculando cada mistura de diluição em camundongos de laboratório. Assim é calculada a diluição máxima (mais alta) que causa a morte dos animais infectados. O volume inoculado causou a morte dos animais contendo uma dose mínima letal (MLD).
Quando conhecida a dose mínima letal, calcular a dose mínima não letal (dmnm) correspondente à quantidade mínima de toxina na presença de uma quantidade constante de antitoxina, que não mata ratos inoculados. Esta quantidade de toxina está sendo neutralizada pelas unidades correspondentes de anti-A antiotoxina ou anti-B antitoxina. A dose mínima não letal é chamada porque é a quantidade mínima de toxina que não causa a morte dos ratos na presença de antitoxina.
Testes oferecidos pelo IVAMI e amostras necessárias:
- Detecção de toxina botulínica em casos humanos ou surtos de botulismo de origem alimentar:
- Soro de Paciente (5 mL pelo menos) mais recentemente obtido para inoculação em ratos e tipagem de toxina, caso os ratos fossem afectados.
- Em casos de botulismo infantil ou botulismo intestinal, a toxina botulínica pode ser detectada nas fezes de crianças/pacientes, mas recomendamos mais aconselhável a realização de uma cultura preliminar de fezes.
- Detecção de toxina e/ou Clostridium botulinum em alimentos ingeridos, suspeitos de causar botulismo, ou alimentos sujeitos a controlo
- Amostra do alimento suspeito ou verificado (recomenda-se pelo menos cerca de 100 gramas) para preparar uma amostra destinada à inoculação de ratos e detectar a presença da toxina pré-formada nos alimentos, bem como para realizar uma cultura para obter o filtrado para inocular ratos e determinar se havia uma bactéria produtora de toxinas na amostra; Se tiver apenas restos de comida, é recomendável enviar a quantidade total disponível.
- Detecção de Clostridium botulinum em casos de botulismo infantil ou botulismo intestinal
- Fechos em casos de botulismo infantil ou botulismo intestinal devido à colonização intestinal (10 g), para cultura e detecção de toxinas em cultura filtrar por inoculação de ratos.
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- Exsudado de ferida em casos de suspeita de botulismo de ferida, para cultura e detecção de toxinas em cultura filtrar por inoculação de ratos. Se a amostra for transportada por via aeróbia, o Clostridium botulinum pode ter sido inactivado, será mais conveniente realizar um teste molecular para a presença de genes de Clostridium botulinum e, se positivo, identificar o tipo de toxina botulínica através da detecção de genes correspondentes a cada tipo de toxina.
- Detecção de Clostridium botulinum em amostras de lodo de água doce ou sedimentos marinhos aquáticos, e outros produtos não incluídos nas secções anteriores
- 100 g de amostras aproximadamente para realizar uma cultura para o crescimento de Clostridium botulinum e obter um filtrado de cultura para inocular ratos.
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- Soro ou plasma (cerca de 10 mL), para testar anticorpos de neutralização no soro ou plasma contra diferentes toxinas disponíveis no laboratório. Este teste é de interesse para determinar a presença de anticorpos específicos em pessoas tratadas com toxina botulínica, em pacientes com suspeita de botulismo infantil, em adultos que não foram capazes de encontrar a bactéria nas fezes, ou em indivíduos vacinados para verificar o status de proteção. Nos casos de pessoas tratadas com toxina botulínica Deve indicar o tipo de toxina administrada ao paciente.
Tempo para relatório de resultados (TAT)
Formulário com características do produto e teste/s escolhido
Volume da amostra
- Veja em cada caso, dependendo do tipo de testes oferecidos pelo IVAMI.
Condições de armazenamento e envio das amostras
- Eles são enviados nas condições em que a amostra é normalmente encontrada, protegida para transporte. No caso de amostras que se possam decompor por estarem contaminadas por bactérias, ou pelo seu próprio orgânico (perecíveis, soros de animais ou humanos, fezes, lamas, … …), as amostras devem ser armazenadas e expedidas congeladas, ou pelo menos nas condições que garantam o arrefecimento durante o transporte (com o recipiente da amostra dentro de uma caixa – poliestireno expandido – (cortiça branca) com as embalagens frias congeladas. Nota: este organismo por si só não apresenta risco de contaminação por exposição biológica.
Custo dos testes
- Inoculação de ratos com soro do paciente ou extracto de alimentos ingeridos ………………………………. …………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………Consultar [email protected]
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- Se for positivo, teste confirmatório para neutralização e identificação do tipo de toxina …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consult [email protected] .
- Detecção de toxina e/ou Clostridium botulinum em alimentos ingeridos, suspeitos de causar botulismo, ou alimentos sujeitos a controlo
- Detecção de Clostridium botulinum em casos de botulismo infantil ou botulismo intestinal
- Opcional: Teste de inoculação de ratos com soro ou extracto de alimentos ingeridos ………………………………….. ……………………………………………………………………………………………………………Consulta [email protected]
- Recomendado. Teste de cultura, seguido de inoculação de ratos com filtro de cultura ………………………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consult [email protected]
- Se for positivo, teste de confirmação para neutralização e identificação do tipo de toxina ……………………. …………………………………………………………………………………………………………..Consult [email protected]
- Detecção de Clostridium botulinum em casos de botulismo de feridas
- Teste de cultura, seguido de inoculação de ratos com filtrado de cultura ……………………. Consulte [email protected]
- Se for positivo, teste de confirmação para neutralização e identificação do tipo de toxina …………….. …………………………………………………………………………………………………………..Consultar [email protected]
- Detecção de Clostridium botulinum em amostras de lodo / água doce ou sedimentos marinhos, e outros produtos não incluídos nas secções anteriores
- Teste de cultura, seguido de inoculação de ratos com filtrado de cultura ……………………. Consulte [email protected]
- Se for positivo, teste confirmatório de neutralização e identificação do tipo de toxina ………………. …………………………………………………………………………………………………………..Consult [email protected]