Discussão

A microbiota humana compreende mais de mil espécies bacterianas distintas e desempenha um papel importante na saúde humana, promovendo o fornecimento de nutrientes, prevenindo a colonização de patógenos e moldando e mantendo a imunidade normal da mucosa. As bactérias intestinais comuns têm sido apreciadas recentemente como tendo uma verdadeira relação simbiótica com o hospedeiro; dentro deste grande conjunto de bactérias, os suplementos probióticos contendo LAB (ou seja, Lactobacilos e Bifidobactérias) têm sido alegados como tendo uma variedade de efeitos benéficos na saúde humana, tais como a prevenção de diarréia e doença inflamatória intestinal ou a profilaxia de infecções urogenitais . No entanto, o nosso conhecimento dos papéis bioquímicos que determinadas espécies e estirpes desempenham na saúde humana e na doença é severamente limitado. Neste estudo visamos avançar na compreensão das vias de redução de nitratos em espécies bacterianas comuns seleccionadas que colonizam o intestino humano utilizando condições in vitro compatíveis com dietas ricas em nitratos e níveis de oxigénio encontrados nas superfícies mucosas do tracto gastrointestinal. Os principais resultados da nossa investigação indicam que: 1) E.coli, um anaeróbio facultativo, converte nitrato em nitrito e subsequentemente em amónia que se acumula progressivamente nos meios de cultura; 2) L.plantarum, uma bactéria fermentativa, cultivada na presença de heme exógeno e vitamina K2 realizam processos semelhantes; 3) As enzimas E.coli geram NO significativo a partir de nitritos apenas em condições anaeróbias; 4) Todas as culturas LAB examinadas geram grandes quantidades de ácido láctico causando acidificação suficiente dos meios de cultura para conduzir a desproporção de nitritos ao NO.

Muitas eucariotas derivam sua energia principalmente através da fosforilação oxidativa e devem respirar O2 para a formação de ATP, entretanto muitas bactérias entéricas, incluindo as cepas de E.coli K12, podem usar NO3- como um aceitador alternativo de elétrons quando o O2 é limitador e o nitrato é abundante. A E.coli representa o membro modelo das Enterobacteriaceae e embora esta família constitua apenas uma pequena fracção da microbiota intestinal, é particularmente importante porque certas estirpes podem causar doenças. Foi também recentemente demonstrado que o nitrato gerado como subproduto da inflamação do hospedeiro pode ser utilizado pela E.coli durante a respiração para conferir um benefício de crescimento e superar os micróbios residentes no cólon que dependem apenas da fermentação. L. plantarum é considerado um probiótico seguro e é comumente encontrado no trato intestinal de mamíferos, bem como na saliva humana, onde se sabe que os nitratos se acumulam a níveis milimolares devido ao ciclo entero-salivar do nitrato, que responde por cerca de 25% do nitrato total em circulação. Esta bactéria apresenta a típica via heterofermentativa facultativa da família LAB, mas, única para esta espécie, genes que codificam um sistema putativo de nitrato redutase (narGHJI) foram recentemente identificados no genoma L. plantarum WCFS1, o que sugere que é capaz de utilizar o nitrato como um aceitador de electrões . De facto, uma análise genética de L. plantarum recentemente publicada destacou a sua enorme capacidade metabólica diversificada e versátil .

Nas nossas experiências foi detectada uma actividade significativa de nitrato redutase tanto em E.coli, como em L. plantarum à medida que a tensão de oxigénio diminui do nível atmosférico para zero. Pelo contrário, B.longum infantis, um anaeróbio microaero tolerante de origem gastrointestinal infantil, não mostrou nenhuma capacidade de reduzir o nitrato mesmo em concentrações elevadas. As bifidobactérias representam até 90% das bactérias do tracto gastrointestinal infantil e os nossos resultados estão de acordo com a observação de que o leite materno humano, que apresenta níveis particularmente elevados de nitritos , fornece uma fonte alimentar para os nitritos antes do estabelecimento da microbiota lingual e intestinal capaz de reduzir os nitratos que normalmente se encontram na flora adulta.

Na Fig. 1 mostramos que as culturas de E.coli contendo 5 mM NO3- tinham uma vantagem competitiva de crescimento em relação às culturas sem adição de nitrato e então determinamos o efeito dos gradientes de oxigênio e nitrato sobre a produção de nitritos e amônia. Nossos resultados indicam que aproximadamente 2,5 mM NO3- a 4% ou menos de O2 é suficiente para induzir a expressão de enzimas redutase nitrato e que após 24 h uma quantidade considerável de nitritos acumulados tanto dentro das células de E.coli como nos meios de cultura. Uma análise molecular detalhada da regulação das actividades enzimáticas bacterianas transcende o âmbito deste estudo, contudo é bem conhecido que as estirpes de E.coli K12 expressam três cepas de nitrato contendo molibdénio redutase e que o tungsténio pode desactivar estas enzimas substituindo o átomo de molibdénio no local activo. Descobrimos que a adição de 300 μM de óxido de tungsténio a culturas cultivadas como em experiências relatadas na Fig. 1 aboliu quase completamente a formação de nitritos (dados não mostrados). Assim, acreditamos que as reduções de nitrato dependentes do molibdênio são responsáveis pelo passo crucial na formação dos nitritos. É também importante notar que a E.coli, assim como muitas outras espécies de bactérias, são susceptíveis à toxicidade dos nitritos devido à formação de complexos metal-nitrosil e minimizam esta toxicidade pela indução coordenada de um transportador de membrana de nitritos e outras enzimas que medeiam a redução dos nitritos. Uma descrição completa dos genes das enzimas nitrato de E.coli e nitrito redutase e regulação e expressão dos óvulos pode ser encontrada em excelentes publicações de Stewart e Cole .

Vias de redução dos óxidos de nitrogênio no intestino humano

A presença de nitrato e nitrito no trato gastrointestinal inferior depende de inúmeros aspectos, incluindo os tipos de bactérias que colonizam o intestino e o intricado equilíbrio entre a dieta e as vias metabólicas dos óxidos de nitrogênio. No entanto, a produção endógena de nitrato a partir da oxidação de NO (principalmente através da reação com a oxihemoglobina) tem sido reconhecida há muito tempo como sendo uma ordem de magnitude maior do que a ingestão dietética, como mostrado no final da década de 1970 e mais recentemente em estudos utilizando camundongos com eNOS-deficiente. Na representação esquemática da Fig. 5 resumimos a ligação entre desnitrificação respiratória bacteriana, redução de óxidos de nitrogênio para amônia, a via endógena L-arginina/NO synthase e a redução de nitritos não enzimáticos para NO. No processo de desnitrificação (caixa vermelha), o nitrato é reduzido a gás nitrogênio (N2) em um processo de quatro etapas no qual nitritos, NO e óxido nitroso são aceitadores de elétrons em reações geradoras de energia. Recentemente foi comprovada a existência de uma via completa de desnitrificação, levando à produção de N2, na placa dentária humana e, embora ainda seja considerada de menor importância em humanos, especula-se que ela possa ter um papel importante sob muito baixa tensão de oxigênio na presença de nitrato e a formação de N2 não pode ser excluída no intestino humano. A desnitrificação e a redução do nitrato dissimilatório à amônia (DNRA, caixa azul) compartilham a primeira etapa de redução do nitrato à nitritos e várias classes de redutoras de nitrato têm sido associadas a esta reação. No DNRA o segundo passo é a redução directa dos nitritos à amónia seis electrões, que não fornece energia mas é um processo de desintoxicação bastante comum nas bactérias anaeróbias facultativas. O DNRA tem sido sugerido para representar a principal via do metabolismo dos nitratos no rúmen dos mamíferos. Este estudo identificou a amônia como um produto de redução de nitrato nas bactérias E.coli e Lactobacilli cultivadas na presença de nitrato mM a 4% de oxigênio ou níveis mais baixos.

Expandir

Desnitrificação respiratória também pode gerar pequenas mas relevantes quantidades de NO como produto intermediário e tem sido implicada na produção bacteriana de NO no intestino. Outras vias possíveis que produzem NO são a conversão ácida de nitrito (caixa verde) e a oxidação da L-arginina pelas enzimas NOS (círculo castanho). Na Fig. 4C examinamos a dependência do próton da desproporção não enzimática do nitrito e mostramos que ela só se torna relevante quando o pH intracelular ou dos fluidos corporais é inferior a 5,5. Nossos resultados também excluíram a presença de enzimas NOS ativas em E.coli e L.plantarum, porém sabe-se que células epiteliais intestinais produzem NO através da expressão de ambas as isoformas endoteliais e induzíveis de NOS. Curiosamente, a produção de NO no intestino poderia ser desencadeada também pelos processos enzimáticos das peroxidases, que são abundantes nas células da mucosa intestinal e têm demonstrado usar nitrito como substrato para produzir NO como parte de sua ação antibacteriana.

Acreditamos que todas essas diferentes vias de redução de nitrato podem coexistir e ocorrer simultaneamente, porém é provável que apenas um metabolito predomine, dependendo das condições fisiológicas específicas.

Impacto fisiológico da formação de NO pela redução bacteriana de nitrato

Nitrato dietético e nitrito ainda são retratados como possíveis substâncias tóxicas em muitos estudos, apesar da crescente evidência de que a produção de NO a partir desses íons tem importantes implicações benéficas para as funções cardiovascular, imunológica e gastrointestinal . No intestino o NO serve várias funções fisiológicas tais como regulação do fluxo sanguíneo da mucosa, mobilidade intestinal e espessura do muco. A superprodução crônica de NO também tem sido associada à doença inflamatória intestinal e é provável que iniba o crescimento de uma grande variedade de espécies de bactérias. Estudos anteriores não deixaram claro como as bactérias intestinais produziram NO, entretanto Sobko et al. mostraram que em contraste com ratos convencionais, os níveis de NO no intestino de ratos livres de germes são extremamente baixos e quando inoculados com flora bacteriana normal a produção observada de NO aumentou 10 vezes.

Em nossas experiências as concentrações de oxigênio e prótons determinaram a rota específica de redução de nitrato para NO. Os resultados apresentados na Fig. 4A indicam que a E.coli é capaz de realizar actividade enzimática de NO em condições anaeróbias com concentrações de nitrato superiores a 1 mM possivelmente através da desnitrificação ou da enzima periplasmática citocromo c nitrito redutase (Nrf) como proposto por Corker e Poole . Esta geração de NO, no entanto, é muito reduzida a 2% de oxigénio e torna-se independente dos nitratos. É importante salientar que os nossos dados são consistentes com o relatório da Sobko e colegas que a E. coli gerou níveis insignificantes de NO durante 24 h de incubação com nitrato 0,1 mM . O LAB produziu quantidades consideráveis de NO em resposta à acidificação dos meios devido ao acúmulo de ácido láctico. A substituição do meio de crescimento por LMRS fresco (pH = 6,5) bloqueou quase completamente a capacidade das culturas de LAB para converter nitritos em NO mas não em E.coli. As medidas do pH do intestino variam entre 5,7 e 7,5, portanto a desproporção de nitritos in vivo é provavelmente um aspecto menor e localizado da produção de NO. Inversamente, esse caminho é um fenômeno bem estabelecido no ambiente ácido do estômago (pH cerca de 3).

Em resumo, sugerimos que o NO gerado pelas bactérias intestinais nas proximidades da mucosa intestinal pode ou exercer os efeitos benéficos observados acima ou em níveis mais altos, interferir com essas funções. Assim, a formação de NO bacteriano no intestino pode ser considerada como modulador dos efeitos fisiológicos e patológicos.

Impacto fisiológico da formação de amônia bacteriana para a saúde

Bactérias colônicas são conhecidas por produzir amônia a partir da desaminação por aminoácidos ou via urease, a hidrólise da uréia em dióxido de carbono e amônia desde os estudos seminais de Vince et al. no início dos anos 70. Mais recentemente Cole e colegas relataram que o principal produto da redução de nitritos na E.coli é a amônia, com cerca de apenas 1% sendo reduzida para NO a pH neutro. Os resultados obtidos em nosso estudo sugerem que pelo menos certas bactérias intestinais comuns principalmente reduzem os nitritos a amônia em vez de NO. Em indivíduos saudáveis, sob condições fisiológicas normais, a maior parte da amónia gerada no tracto gastrointestinal inferior é então excretada nos fluidos corporais e metabolizada pelos hepatócitos hepáticos onde a amónia e o dióxido de carbono são enzimaticamente convertidos em fosfato de carbamoyl, o que entra na série de reacções chamada “Ciclo da Ureia” que leva à formação de ureia e à sua eliminação pelo rim (ver Fig. 5). A concentração plasmática normal de amônia está na faixa de 10-35 μM, porém, quando a produção de amônia é excessiva, a amônia portadora de sangue portal pode desviar o fígado levando à hiperamonemia. A amônia no sangue permeia livremente através da barreira hematoencefálica e níveis elevados (>100 μM) têm efeitos tóxicos no sistema nervoso central levando à encefalopatia e eventualmente ao coma. Pacientes com cirrose hepática desenvolvem muito frequentemente encefalopatia hepática (HE) . Na ausência de insuficiência hepática, o coma hiperamonémico tem sido atribuído à sepsis por microrganismos capazes de urease como a pneumonia por Klebsiella . As abordagens terapêuticas clássicas para a HE envolvem a redução dos níveis de amônia sistêmica via tratamento antibiótico (para matar bactérias produtoras de amônia intestinal) e administração de açúcares não absorvíveis, como a lactulose e o lactitol . No intestino grosso a lactulose é decomposta pela acção das bactérias cólicas principalmente ao ácido láctico, e também a pequenas quantidades de ácidos fórmicos e acéticos . Esta acidificação favorece a formação do íon amônico não absorvível a partir do amoníaco e reduz a sua concentração no plasma. Não está claro em que medida o nitrato dietético contribui para a concentração de amônia no intestino e no sangue, entretanto sugerimos a hipótese alternativa de que o aumento da acidificação do conteúdo de cólon devido à presença de lactulose favorece a conversão de microbiota de nitrito em NO ao invés de amônia pelo conhecido mecanismo dependente de ácido.

Conclusões

Por mais de 30 anos o destino biológico do nitrato exógeno não pôde ser contabilizado nos compostos contendo nitrogênio excretado, o que equivale a aproximadamente 60% de uma dose ingerida de nitrato em humanos. Nossos resultados apoiam a idéia de que o nitrato é convertido em nitrito e depois em outras biomoléculas de nitrogênio reduzido, como NO, amônia, uréia e possivelmente gás nitrogênio por bactérias na saliva, estômago, intestino delgado e grosso. Questões como a quantidade de amônia gerada pela redução de nitrato nitrito versus outros processos importantes, como a desaminação e a atividade das bactérias aumenta, exigem estudos metabólicos detalhados em animais e/ou humanos. O significado biológico da conversão dos nitratos alimentares na luz intestinal ainda está por estabelecer. No entanto, as dietas tradicionais japonesa e mediterrânica, que são conhecidas por terem efeitos protectores cardiovasculares, têm uma ingestão média de nitrato por pessoa 2 a 3 vezes superior à dieta ocidental típica (nos Estados Unidos corresponde a cerca de 40-100 mg/dia de nitrato). É necessária mais investigação sobre a ligação entre bactérias simbióticas, o metabolismo dos óxidos de azoto e a saúde humana; contudo, é evidente que as vias biológicas do metabolismo do azoto nos mamíferos são mais complexas e mais importantes do que se previa há alguns anos atrás.