Ciclo celular ao longo da raiz primária do milho

Raíz primária do milho foi dividida em segmentos consecutivos que indicavam os limites da tampa da raiz, zona de alongamento do meristema apical e zona de diferenciação, de acordo com resultados anteriores (Alarcón et al., 2016). A distância da RCJ até o ápice radicular foi estimada em 457 µm, que foi removida antes de se dividir a raiz em várias zonas. A zona meristemática apical radicular (MZ) está localizada na zona mais apical de 1,5 mm de raiz da RCJ e a zona de transição (TZ) continuou a 3 mm. A zona de alongamento rápido (EZ), onde as células se alongaram rapidamente, foi atribuída a 3-6 mm; e em regiões distantes de 6 mm observamos que a taxa de alongamento celular começa a diminuir, indicando a zona terminal de crescimento (Verbelen et al., 2006). As zonas localizadas 12-20 mm e 20-30 mm da RCJ são zonas de diferenciação (DF), onde as raízes laterais iniciam o seu desenvolvimento. Dissecções semelhantes de raízes foram feitas em Arabidopsis, onde a raiz foi dissecada em cinco secções mais curtas do que as da raiz do milho (Cools et al., 2010). Recentemente, uma expressão diferencial de genes ao longo da raiz da Arabidopsis foi relatada, e os genes reprimidos ou induzidos variam principalmente na mudança da meristemática para as zonas de transição, assim como da transição para a zona de alongamento (Chaiwanon e Wang, 2015).

O limite do meristema radicular é determinado pela saída do ciclo celular e pelo equilíbrio entre a divisão celular e o alongamento celular (Perilli et al., 2012). O perfil da citometria de fluxo mostra a progressão do ciclo celular ao longo da raiz primária, e os dados que mostram o número de células relativas nas fases do ciclo celular indicam a atividade celular em várias zonas da raiz. Portanto, quando as células saem do ciclo celular, elas podem interromper o ciclo. Além disso, geralmente assume-se que a saída celular do ciclo celular ocorre após a mitose, e a decisão de entrar em um novo ciclo celular é feita no ponto de transição G1 para S em resposta a fatores de crescimento e vários hormônios (Gutierrez et al., 2002; Inzé e De Veylder, 2006; Polyn et al, 2015).

Na Fig. 1 mostramos que, em raízes de 150-160 mm cultivadas a 30°C, o meristema está praticamente restrito a MZ, a zona 0-1,5 mm da RCJ onde as porcentagens de células nas fases G0/G1-, S-, e G2/M- foram aproximadamente 27, 23 e 39, respectivamente (Tabela 1). A duração relativa para G1, S, G2 e M no meristema Allium foi estimada em 26,5, 44,5, 16,5 e 12,5%, respectivamente (Giménez-Martín et al., 1977), e essas porcentagens são muito semelhantes em outras espécies. Embora nossos resultados relataram que o meristema do milho tem uma porcentagem menor de células na fase S, os valores (23%) foram suficientes para indicar a progressão do ciclo celular (Reichheld et al., 1999). Estas proporções relativas mudaram extraordinariamente quando a TZ é analisada, nesta zona. As porcentagens foram 9, 10 e 68%, para as fases G0/G1, S e G2/M, respectivamente. Este resultado sugere que as células começaram a sair do ciclo celular quando atingiram 1,5 mm da RCJ. Além disso, as porcentagens em EZ sugerem que a 3 mm as células estão fora do ciclo celular (Fig. 1, Tabela 1). Além disso, a diminuição da porcentagem de células nas fases G0-G1 e S foi compensada com um aumento em G2-M (Tabela 1, Fig. 2). Estes resultados mostram claramente que as células param o ciclo celular quando estão na fase G2.

Foi relatado que a maioria dos tipos de células deixam o meristema na fase G1, e ultimamente a transição de G1 para G1 só é desencadeada em células periculares para iniciar a raiz lateral (Vanneste et al., 2007). No periciclo de Arabidopsis, células adjacentes a pólos protoxileares têm sido propostas para continuar o ciclo celular sem interrupção quando passam por zonas de transição, alongamento e diferenciação (Dubrovsky et al., 2008). Estas células são as únicas que se dividem para iniciar a primordia lateral da raiz. Entretanto, o resto das células que constituem a raiz não se dividem. Então, as células epidérmicas e córtex que compõem a maioria dos tecidos radiculares não continuam a ciclo quando deixam o meristema radicular.

Em nossa análise observamos um aumento notável de células na fase G2 em TZ e EZ. Este resultado sugere que as células que saem do meristema na fase G2 não sofrem mitose, mas param nesta fase G2 e permanecem nela. Especulamos que as células que saem do meristema na fase G1 ou S continuam o ciclo celular para G2, onde param. Isto é baseado na observação de que a diminuição do percentual de células em G0/G1 entre MZ e TZ (29,7%) é compensada com um aumento em G2 (28,8%) (Tabela 1, Fig. 2). Uma diminuição fraca da percentagem de G2 é alcançada entre a EZ e a extremidade basal de DZ (20-30 mm da RCJ). Esta pequena diminuição, juntamente com a diminuição dos núcleos hiperplóides, é compensada pelo aumento dos níveis hipoplóides (Tabela 1).

Por outro lado, foi relatado que as TZ na raiz do ápice do milho não estão envolvidas em divisões mitóticas, e nesta zona os núcleos pós-mitóticas estão localizados numa posição central dentro da célula (Baluška et al., 2001). Além disso, não foram observadas figuras mitóticas ao longo da zona radicular; a iniciação lateral da raiz primordia foi observada entre 20-25 mm da RCJ (Alarcón et al., 2016). Em Arabidopsis, a distância média para a mitose mais precoce no periciclo é de 3194 µm e a primeira mitose foi observada a 2205 µm da ponta da raiz (Dubrovsky et al., 2001). Na raiz do milho, apenas a 20-30 mm da RCJ, algumas células do periciclo oposto ao xilema mostraram citoplasma de condensado, indicando que estão reentrando no ciclo celular (Alarcón et al., 2016). Estas diferenças podem ser causadas pela maior taxa de alongamento da raiz do milho que cresce 80-90 mm/dia, enquanto que a Arabidopsis alonga apenas 10 mm/dia (Dubrovsky et al., 2001).

Foi demonstrado usando uma análise microscópica quantitativa tecidual específica que algumas células do córtex e epiderme estavam no primeiro endociclo (conteúdos de DNA entre 4C e 8C) no início do seu alongamento. Além disso, núcleos de elementos metaxila na zona de transição realizaram um ou dois endociclos atingindo 32C em seu início de alongamento rápido (Baluška, 1987, 1990; Baluška e Kubica, 1984; Baluška et al., 1995). Recentemente, a endoreduplicação tem sido descrita para ocorrer em plantas antes das células iniciarem a diferenciação (De Veylder et al., 2007). Entretanto, não observamos um número relevante de núcleos com nível de ploidia superior a 4n. Além disso, se a endoreduplicação fosse um processo comum na ponta da raiz do milho, esperaríamos que a hiperploidia aumentasse à medida que analisamos zonas mais afastadas da RCJ. No entanto, a hiperploidia não só não aumentou nas zonas de alongamento, mas diminuiu (Tabela 1).

Foi relatado que as células periculares permanecem na fase G1 até que elas reentram no ciclo celular (Vanneste et al., 2007). Entretanto, as células de periciclo representam apenas uma pequena fração da quantidade total de células que formam as pontas da raiz; células epidérmicas e córtex são os tipos de células mais abundantes no ápice da raiz. Então, se cerca de 70% do total de células abandonam o meristema na fase G2, a maioria das células epidérmicas e córtex deve estar em G2 quando deixam o meristema. Assume-se que o alongamento celular epidérmico e córtex controla o crescimento longitudinal da raiz (Alarcón et al., 2014b). Portanto, as células envolvidas no processo de diferenciação que resulta no alongamento radicular devem estar na fase G2.