RESULTA E DISCUSSÃO
Uma linha de células de melanoma A375 com um MAPK ativado constitutivamente devido a uma mutação do BRAFV600E foi tratada com o inibidor MEK U0126 numa concentração de 25 μM durante 8 h, resultando na supressão da fosforilação ERK (Fig. 1 a). O fator imunossupressor solúvel mRNAs, incluindo IL-6, IL-10 e VEGF, diminuiu significativamente com o tratamento U0126 (Fig. 1 b), enquanto o tratamento de controle DMSO não afetou a produção de IL-10 e VEGF mRNAs, e aumentou apenas ligeiramente o nível de IL-6 mRNA. Uma exposição de 18 horas ao U0126 também suprimiu a produção de IL-10, VEGF e IL-6 no nível de proteína, indicando que as ERKs ativadas podem ser responsáveis pela supressão das respostas imunológicas locais contra o melanoma através da produção desses fatores imunossupressores (Fig. 1 c). Além disso, a supressão da fosforilação ERK e a inibição da produção de IL-6, IL-10 e VEGF ocorreu mesmo após a redução da concentração do tratamento U0126 para 10 μM (não ilustrado). Durante este estudo, não foram observados efeitos citotóxicos significativos com o tratamento U0126 das células A375. Embora o U0126 seja conhecido por inibir o MEK5 além do MEK1/2, o ERK5 fosforilado, o substrato MEK5, não foi detectado nas células A375 (não representado), indicando que o caminho do MEK1/2-ERK1/2 é responsável pelos efeitos observados com o tratamento U0126. Os efeitos supressores do U0126 na produção de IL-10 e VEGF também foram demonstrados em três outras linhas de células de melanoma com a mutação BRAFV600E, 624mel, 888mel e 928mel, sem qualquer toxicidade celular significativa (Fig. 1 d). Como essas linhas celulares de melanoma não produzem IL-6, a sinalização MAPK ativada parece ter um papel geral na produção de fatores imunossupressores IL-10 e VEGF nas linhas celulares de melanoma BRAFV600E+.
Produção diminuída de fatores imunossupressores solúveis IL-6, IL-10 e VEGF a partir de linhas de células de melanoma com MAPK constitutivamente ativo através da mutação do BRAFV600E por inibição da sinalização MAPK com um inibidor MEK, U0126. (a) A inibição da fosforilação do ERK1/2 foi detectada pela análise Western blot da linha celular de melanoma A375mel com a mutação do BRAFV600E antes e 2, 4, 6, e 8 h após o tratamento com o inibidor MEK U0126 a uma concentração de 25 μM. (b) Inibição da expressão do mRNA para fatores imunossupressores solúveis IL-6, IL-10, e VEGF em células A375. Os mRNAs para vários fatores solúveis, incluindo IL-6, IL-10 e VEGF, foram medidos por RT-PCR quantitativo antes e 2, 4, 6 e 8 h após o tratamento com U0126. O tratamento de controle foi realizado com uma solução de DMSO. Os níveis de mRNA em cada ponto de tempo foram normalizados para GAPDH mRNA e indicados como o valor relativo ao de 0 h. (c) Diminuição da produção de IL-6, IL-10 e proteínas VEGF a partir de células A375 após um tratamento de 18 h com U0126 a uma concentração de 25 μM. A expressão foi detectada por ELISA com os sobrenadantes de cultura. A razão de viabilidade das células tratadas com U0126 células tratadas com DMSO na colheita foi de 77%. A produção de citocinas foi normalizada para o valor de células de controle tratadas com DMSO com base na contagem de células. A mancha ocidental mostrou forte inibição da fosforilação ERK, mas não da proteína STAT3, ou sua fosforilação em Ser727 e Tyr705. (d) Diminuiu a produção de IL-10 e VEGF a partir de três linhas de células melanoma com a mutação BRAFV600E, 624mel, 888mel e 928mel após um tratamento de 18-h com U0126 a uma concentração de 25 μM, que foi detectada por ELISA com os sobrenadantes de cultura. As proporções de viabilidade das células tratadas com U0126 células tratadas com DMSO na colheita foram de 95% para 624mel, 103% para 888mel, e 100% para 928mel. A produção de citocinas foi normalizada para o valor das células de controle tratadas com DMSO com base na contagem de células. A mancha ocidental mostrou forte inibição da fosforilação ERK, mas não da proteína STAT3. Uma ligeira diminuição da fosforilação Ser727 de STAT3 foi observada em 888 e 928 células de STAT3, mas não em 624 células de STAT3. Estes resultados são representativos de três ou quatro experiências independentes com resultados semelhantes.
No entanto, os efeitos não específicos do U0126 na produção de citocinas por vias diferentes da sinalização MAPK não podem ser completamente descartados destas experiências devido à ligeira diminuição observada na fosforilação STAT3 em Ser727 em 888mel e 928mel (Fig. 1 d). Para confirmar o papel do MAPK ativado devido à mutação do BRAFV600E na produção de IL-10, VEGF e IL-6, o RNAi específico do BRAFV600E foi transformado em três linhas de células melanoma, A375, 888mel e 624mel, utilizando o lentivírus que expressa o RNA curto específico do BRAFV600E (shRNA) (11). O RNAi específico do BRAFV600E inibiu significativamente a produção de IL-10, VEGF e IL-6, bem como a fosforilação ERK suprimida (Fig. 2). Esses resultados confirmam que a inibição desses fatores pelo U0126 (Fig. 1) está correlacionada com a inibição específica da via MAPK. Esses resultados são consistentes com trabalhos recentes mostrando a produção de IL-10 induzida por ERK1/2 em macrófagos murinos (12) e VEGF dependente de BRAFV600E para promoção da angiogênese (13).
Produção diminuída de fatores imunossupressores IL-6, IL-10 e VEGF a partir de três linhas de células melanoma com a mutação de BRAFV600E pelo RNAi específico de BRAFV600E. As três linhas de células de melanoma com a mutação BRAFV600E, A375mel, 888mel e 624mel, foram infectadas com os vetores lentivírus que codificam o RNA de grampo capilar curto para mRNA luciferase luciferase (GL3B; como controle) ou mRNA BRAFV600E (BRAF#1′) com 50 ou 100 multiplicidade de infecção. Aos 5 ou 6 d após a infecção, as proteínas foram extraídas e submetidas a análise de Western blot. A diminuição profunda da fosforilação do ERK1/2 com diminuição da proteína BRAF foi observada pelo RNAi específico do BRAFV600E. Não foi observada diferença significativa na proteína STAT3 e fosforilação da STAT3 em Ser727 ou Tyr705. Uma ligeira diminuição da fosforilação no Ser727 foi observada em 888mel e 624mel células após BRAF RNAi. 5 ou 6 d após a infecção pelo lentivírus, o mesmo número de células de melanoma foi administrado a uma densidade de 1-2 × 106 células/2 ml, e os sobrenadantes de cultura após 18 h foram submetidos a ELISA para IL-6, IL-10, ou VEGF. Observou-se uma diminuição acentuada da IL-6, IL-10 e VEGF. Um resultado representativo de dois ou três experimentos independentes com resultados semelhantes é mostrado.
Porque a sinalização STAT3 ativada foi determinada para resultar em evasão imunológica do câncer através da produção de vários fatores incluindo o VEGF (8, 9), investigamos a relação entre o MAPK e as vias STAT3 no que diz respeito à produção de fatores imunossupressores na linha de células melanoma A375. A produção de IL-6, IL-10 e VEGF foi profundamente inibida pelo RNAi visando apenas o BRAFV600E ou apenas o STAT3 (Fig. 3 a). Nenhum efeito aditivo claro ou sinérgico foi observado ao restringir simultaneamente as vias BRAF-MAPK e STAT3 (Fig. 3 a). BRAFV600E RNAi nas células A375 não diminuiu a atividade de ligação do DNA STAT3 (Fig. 3 b), a atividade promotora do STAT3 (Fig. 3 c), ou fosforilação STAT3 no Ser727 ou Tyr705 (Fig. 2), embora tenha sido relatado que os ERKs eram potencialmente capazes de fosforilatar STAT3 no Ser727 (14). Entretanto, a fosforilação STAT3 também pode ocorrer por uma via independente do ERK (15). Em 624 células de fósforo, embora tenha havido um ligeiro decréscimo do STAT3 fosforilado com Ser727, a atividade de ligação ao DNA (Fig. 3 b) e a atividade promotora do STAT3 (Fig. 3 c) não foram afetadas pelo RNAi BRAFV600E (Fig. 2). Em 888 células de plasma, houve uma diminuição semelhante da fosforilação Ser727, mas, inversamente, tanto a actividade de ligação do ADN STAT3 (Fig. 3 b) como a actividade promotora do STAT3 (Fig. 3 c) diminuíram após o BRAFV600E RNAi (Fig. 2). Estes resultados sugerem que a redução na atividade de transcrição STAT3 não é o principal mecanismo gerador da supressão do fator imunossupressor através da regulação para baixo da sinalização MAPK nestas linhas de células melanoma.
Inibição da produção de IL-6, IL-10 e VEGF em células A375 através do RNAi apenas para o BRAFV600E, STAT3 apenas, ou ambos, sem alterações significativas na atividade de ligação de DNA e promotor do STAT3. (a) Inibição profunda da produção de IL-6, IL-10 e VEGF em A375 através do RNAi para BRAFV600E sozinho, STAT3 sozinho, ou ambos. 5 ou 6 d após a infecção, o mesmo número de células foi administrado a uma densidade de 106 células/2 ml, e o sobrenadante de cultura após 18 h foi submetido a ELISA para IL-6, VEGF, e IL-10. A diminuição de BRAF e ERK1/2 fosforilado pelo RNAi específico de BRAFV600E e a diminuição de STAT3 pelo RNAi específico de STAT3 foram confirmadas pela análise Western blot. Um resultado representativo de seis experimentos independentes com resultados semelhantes é mostrado. (b) Nenhuma alteração significativa da atividade de ligação do DNA STAT3 pela inibição da sinalização MAPK com BRAF RNAi em linhas de células melanoma. STAT3 A atividade de ligação do DNA STAT3 foi examinada pela EMSA dos extratos nucleares das linhas celulares de melanoma com controle GL3B ou BRAF#1′ tratamento vetorial de shRNA. As bandas específicas STAT3 indicadas por setas desapareceram com a sonda de ADN STAT3 de tipo selvagem frio (wt), mas não com a sonda de ADN STAT3 mutante (mt). Apenas uma ligeira diminuição da actividade de ligação de ADN STAT3 foi observada em 888 células STAT3. (c) Os ensaios STAT3 em células A375, 624mel, e 888mel. 2-4 × 105 células com controlo ou BRAF#1′ infecção vectorial por shRNA foram transfectadas com 0,4 μg pSTAT3-TA-Luc e 0,4 μg pRL-SV40 com Effectene Transfection Reagent. 24 h após a transfecção, as células foram colhidas e analisadas para a actividade de pirilampo e renilla luciferase. Cada atividade de luciferase de vaga-lume foi normalizada com a atividade de renilla luciferase. As barras sombreadas e as barras de erro indicam a média e o desvio padrão dos ensaios triplicados, respectivamente. Um experimento representativo de três ou quatro experimentos independentes é mostrado. A transcrição conduzida pelo STAT3 não foi alterada após o BRAF RNAi em A375 e 624mel, mas diminuiu ligeiramente em 888mel.
Nexterior, foram investigados os efeitos potenciais causados pelos fatores solúveis induzidos pela sinalização MAPK e STAT3 no sobrenadante das culturas A375 sobre a maturação das CD. O sobrenadante das células do melanoma A375 em cultura contém fatores solúveis que inibem a maturação da CD humana derivada de monócitos (MoDC) quando estimulado com ligandos receptores tipo Toll-like como o LPS. A adição dos sobrenadantes da cultura do A375 às culturas de MoDC numa concentração final de 10-20% diminuiu significativamente a produção de citocinas inflamatórias, incluindo IL-12 e TNF-α, nos MoDCs, bem como nas moléculas de superfície celular CD1a e CD83, mas não CD80, CD86, CD40, ou HLA-DR nos MoDCs. Os sobrenadantes das outras três linhas celulares de melanoma produziram os mesmos resultados quando adicionados às culturas de MoDC (não retratados). A atividade supressora dos sobrenadantes das células melanoma deriva da produção de IL-6, IL-10 e VEGF porque a adição de anticorpos específicos para esses fatores reduziu a atividade supressora dos sobrenadantes da cultura A375 (Fig. 4 a). Disparidades entre nossas observações e os resultados previamente relatados em relação ao sobrenadante de células de melanoma murino B16 com um STAT3 ativado inibindo a expressão de MHC classe II e CD40 podem ser explicadas por diferentes células tumorais ou espécies (8).
Actividade supressora diminuída dos sobrenadantes da cultura do melanoma A375 através do pré-tratamento com RNAi apenas para BRAFV600E, STAT3 apenas, ou ambos na produção de IL-12 e TNF-α induzida por LPS a partir de CD. (a) A neutralização da IL-6, IL-10 ou VEGF nos sobrenadantes de cultura de células do melanoma A375 restaurou a inibição da produção de IL-12 a partir de CD humanas estimuladas por LPS. Os MoDCs humanos foram cultivados com os sobrenadantes A375 na presença ou ausência do anticorpo monoclonal para IL-6, IL-10, VEGF, ou um anticorpo de controle de isotipo em 1 μg/ml. A produção de IL-12 nos sobrenadantes da cultura foi determinada pelo ELISA 24 h após a estimulação LPS a 100 ng/ml. (b) Os monócitos CD14+ foram isolados de PBMCs usando MACS e cultivados nos meios contendo RPMI 1640, 10% (vol/vol) FBS, 100 ng/ml GM-CSF, e 50 ng/ml IL-4 com ou sem 20% (vol/vol) do sobrenadante de cultura das células A375mel preparadas na Fig. 3. (a) Metade dos meios de cultura, citocinas e o sobrenadante de cultura foi trocado a cada 2 d. No dia 5 da cultura, o LPS foi adicionado a 100 ng/ml. Após 15 h, os sobrenadantes de cultura foram coletados e submetidos a ELISA de IL-12 e TNF-α.
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A atividade supressora dos sobrenadantes de cultura A375 na produção de IL-12 e TNF-α dos MoDCs tratados com LPS foi restaurada através do pré-tratamento das células A375 com RNAi visando apenas BRAFV600E, STAT3 apenas, ou ambos BRAFV600E e STAT3 (Fig. 4 b). Embora o STAT3 RNAi parecesse reduzir mais a atividade supressora dos sobrenadantes da cultura do A375 do que o BRAFV600E RNAi, a diferença pode ser simplesmente causada por diferentes atividades do RNAi. Entretanto, é importante notar que não foram observados efeitos aditivos e sinérgicos pelo RNAi que visavam simultaneamente o BRAF e o STAT3; novamente, indicando os papéis essenciais de ambas as vias de sinalização na produção de fatores supressores na maturação DC. Embora a ativação das CD pelo sobrenadante da linha celular do câncer de cólon murino CT26 transfectado com uma forma dominantemente negativa do STAT3 possivelmente através do aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias tenha sido relatada, a ativação das CD não foi observada neste estudo. Isso pode ser explicado por uma inibição incompleta do BRAF e do STAT3, pela ausência de aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias nas células de melanoma transmitidas por shRNA do BRAF, ou por diferenças nas células tumorais ou espécies.
Em resumo, demonstramos pela primeira vez um papel essencial da sinalização MAPK juntamente com a via STAT3 na produção de vários fatores imunossupressores nas linhas celulares de melanoma com MAPK constitutivamente ativo devido à mutação comum do BRAFV600E. Assim, a via MAPK pode ser um alvo molecular potencialmente significativo para superar a evasão imunológica de vários cancros porque é freqüentemente ativada em vários tipos de cânceres, incluindo o melanoma sem a mutação do BRAFV600E (16, 17).