O objetivo geral deste procedimento é extrair seqüencialmente RNA e DNA de núcleos de tecido fixados em parafina arquivados. Este é um protocolo para a colheita de núcleos de tecido do qual iremos extrair tanto o RNA como o DNA. A principal vantagem deste protocolo é que melhora a produção de RNA e DNA a partir de regiões precisamente visadas no bloco tecidual.

Este procedimento é largamente desenvolvido nos tecidos de câncer de próstata arquivados. Ele também pode ser aplicado a outros tipos de tecidos de arquivo. A demonstração visual deste método é crítica, uma vez que as etapas de coring dos tecidos não são comumente usadas em laboratórios de pesquisa.

A maioria dos laboratórios de pesquisa usa seções transversais em vez disso, o que esgota os tecidos mais rapidamente e adiciona heterogeneidade significativa à amostra. Comece revisando a lâmina do microscópio e delineando a região de interesse usando um marcador permanente de ponta fina. Em seguida, corte uma secção de película de parafina suficientemente grande para cobrir a região de interesse na lâmina do microscópio.

Então, coloque a película firmemente sobre a lâmina, envolvendo a película sobre as bordas para evitar que escorregue. Usando um marcador permanente de ponta fina, contorne todo o tecido e a região de interesse dentro do tecido. Em seguida, retire a película da lâmina e transfira-a para o bloco de tecido correspondente.

Oriente a película virando-a ou rodando-a de modo a que o contorno de todo o tecido corresponda à forma observada do tecido no bloco. Pressione a secção da película firmemente para a superfície do bloco para evitar o deslizamento. Usando a ponta do marcador permanente, fazer reentrâncias rasas mas visíveis ao longo do contorno da região de interesse e depois remover a película.

Próximo, limpar o punção receptor do punção de 0,6 milímetros ajustado submergindo a ponta em tubo de microcentrifugação de 1,5 mililitro contendo um mililitro de lixívia e deslizando o punção para cima e para baixo várias vezes. Repita a lavagem com o tubo contendo 70% de etanol, e depois água. Agora pressione o punção limpo na região de interesse para uma profundidade de três milímetros e retire.

Largar o núcleo em um tubo de microcentrífuga de baixa ligação empurrando-o para fora do punção com o estilete. Adicione um mililitro de xileno aos tubos de microcentrífuga contendo os núcleos de tecido e vortex vigorosamente durante dez segundos. Depois colocar num bloco térmico regulado para 50 graus Celsius durante três minutos.

Seguindo a incubação, centrifugar durante dois minutos à temperatura ambiente à velocidade máxima. Após a centrifugação, colocar os núcleos sobre gelo durante cinco minutos para solidificar o resíduo ceroso. Agora, retire cuidadosamente a parafina que se acumulou ao redor do menisco, juntamente com o sobrenadante, usando uma ponta de pipeta.

Então, repita o tratamento com xileno. Depois de remover a mistura de xileno da parafina, adicione um mililitro de etanol a 100% e vortex vigorosamente durante dez segundos. Após centrifugar na velocidade máxima por dois minutos, descarte cuidadosamente o etanol.

Repita a lavagem com etanol mais uma vez antes de iniciar a homogeneização. Ressuspender os núcleos desparafinizados em 700 microlitros de etanol a 100% antes de iniciar a homogeneização. Use um homogeneizador de tecido motorizado em um ambiente médio para moer os núcleos em partículas finas.

É necessária uma homogeneização completa dos núcleos do tecido para obter um ótimo rendimento de DNA e RNA. Em seguida, preencha tubos separados de 15 mililitros com aproximadamente dez mililitros de lixívia, solução neutralizante RNase e 70% de etanol. Após a homogeneização da amostra, lave a sonda homogeneizadora em cada uma das soluções de limpeza na ordem.

Executar o homogeneizador na maior velocidade durante a fase de lavagem. Limpe a sonda com um lenço de papel e deixe a sonda secar completamente antes de homogeneizar a amostra seguinte. Inspecione visualmente as lâminas da sonda em busca de pedaços de tecido residual e, se encontrado, limpe novamente a sonda.

Poluindo homogeneização, leve o volume da amostra a um mililitro com 100% de etanol, e depois centrifugue na velocidade máxima durante 15 minutos. Aspirar cuidadosamente o etanol e secar os pellets ao ar por aproximadamente 15 a 20 minutos antes de iniciar a extração da proteinase K. Ressuspender os pellets em 150 microlitros de tampão de digestão da proteinase K e agitar os tubos para soltar o pellet.

A digestão da proteinase K é recomendada para uma maior recuperação do DNA. Adicione 10 microlitros de proteinase K estável em temperatura e misture agitando. Incube a 56 graus Celsius durante 15 minutos com ligeira agitação.

Incubar os tubos no gelo durante três minutos. Após arrefecimento, centrifugue o tubo durante 15 minutos à velocidade máxima. Em seguida, sem perturbar as pastilhas, transfira cuidadosamente cada sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga para purificação do RNA.

Extrair RNA e DNA usando o procedimento otimizado no protocolo escrito, que inclui um tempo prolongado de digestão do tecido para extração do DNA. O RNA e o ADN podem ser recuperados a partir de amostras de tecido mais antigas, fixadas em parafina, utilizando este método. Os ácidos nucleicos foram coextraídos de amostras de câncer de próstata variando de três a 14 anos na idade da amostra.

O rendimento médio foi de 2, 270 nanogramas de RNA e 820 nanogramas de DNA. Curiosamente, não houve correlação significativa entre a idade da amostra do tecido e a recuperação do ácido nucleico. Em geral, os rendimentos de RNA e DNA foram correlacionados entre amostras, embora na maioria dos casos, mais do dobro do RNA foi recuperado em relação ao DNA.

Para demonstrar o desempenho do DNA genômico extraído com este protocolo, os extratos de DNA convertidos em bissulfito de amostras de câncer de próstata arquivadas foram amplificados por PCR específica de metilação. Elementos repetitivos da ALU foram usados como controle da metilação e mostraram pouca variação entre amostras. O GSTP1, um gene conhecido por ser hipermetilado no câncer de próstata, não mostrou amplificação detectável por PCR específica de metilação quando foi utilizado ADN extraído de amostras benignas.

Amostras de ADN de pacientes com câncer de próstata agressivo exibiram valores limiares detectáveis do ciclo QPCR que eram inferiores aos das células indolentes do câncer de próstata, indicando um aumento da metilação do GSTP1 no câncer de próstata agressivo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três a quatro horas para o RNA, e após digestão nocturna, em quatro horas para o ADN, se for realizada adequadamente. Esta técnica deve permitir aos pesquisadores em patologia molecular explorar biomarcadores de DNA diagnóstico e RNA em uma variedade de cânceres.

Após assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como preparar núcleos teciduais para extração de DNA e RNA de áreas de interesse precisamente mapeadas em blocos de tecidos de arquivo.